Kvantifikace mikroplastů ve vzorcích životního prostředí s využitím pyrolýzy a GC/MSD

Analýza mikroplastů ve vzorcích životního prostředí je v současné době velice aktuální téma poutající čím dál větší pozornost. V tomto aplikačním listu je představena metoda pro stanovení mikroplastů jako jsou polyethylen (PE), polypropylen (PP) a polystyren (PS). Metoda je založená na extrakci kapalinou za zvýšeného tlaku (PLE) s následnou pyrolýzou a analýzou pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií. GC/MSD umožňuje stanovení mikroplastů ve vzorcích životního prostředí, a to na velmi nízkých koncentracích.

Vlastní analýza byla provedena na sestavě Agilent 5977B GC/MSD, Agilent 7890 GC a naměřená data byla zpracována pomocí softwaru MassHunter. Pro reálné vzorky životního prostředí byla zhodnocena linearita, limity kvantifikace (LOQ) a reprodukovatelnost analytického měření. Velkým nedostatkem dřívějších GC/MSD metod byly obecně limity detekce. Představovaná metoda umožňuje kvantifikovat mikroplasty PE, PP a PS až na hladinách 0,005 mg/g. Z kalibračních vzorků byla dále získána velmi dobrá linearita měření (R2 >0,97), a to v rozsahu 0,005 až 1 mg/g vzorku. Pro vzorky uměle i přirozeně kontaminované byla stanovena relativní směrodatná odchylka (RSD) nižší než 10 %, což ukazuje velmi dobrou reprodukovatelnost a spolehlivost celé analýzy.

Úvod

Mikroplasty jsou běžně definovány jako plastové částice a fragmenty o velikosti menší než 5 mm. Tyto částice se dostávají do životního prostředí z mnoha různých zdrojů a přetrvávají v něm stovky a více let. Pravděpodobnost, že se dostanou do živých organismů a budou jimi kumulovány, je tak velmi vysoká. Toto nebezpečí je hlavním důvodem zvýšeného zájmu o metody, které umožňují jejich kvantifikace ve vzorcích životního prostředí jako je voda, půda a další organické matrice.

Vzhledem k vysoké molekulové hmotnosti a špatné rozpustnosti ve většině rozpouštědel je kvantifikace těchto látek ve vzorcích životního prostředí s použitím tradičních GC/MS a LC/MS/MS technik značně obtížná. Počet částic, identifikace, velikost a plošné rozložení mikroplastů mohou být stanoveny spektroskopickými technikami jako je například infračervená spektroskopie (IČ). Termální extrakce ve spojení s GC/MS pak komplementárně k těmto technikám poskytuje informaci o hmotnostní koncentraci mikroplastů, která může být nepostradatelným údajem pro regulační a monitoringové účely (1,2). Postupy využívající pyrolýzu ve spojení s plynovou chromatografií – hmotnostní spektrometrií (pyr-GC/MS) přinesly již dříve velmi slibné výsledky, nicméně tato technika již tradičně trpí nedostatečnými limity detekce, matričními efekty a nehomogenním rozložením částic mikroplastů ve vzorcích.

Dierkes a kolektiv doporučují pro spolehlivé stanovení plastů ve vzorcích životního prostředí využívat metod s limity kvantifikace nižšími než 1 mg/g (3). Vzhledem k výše uvedeným analytickým omezením vyvinuli pro kvantitativní stanovení mikroplastů na nízkých koncentracích v sedimentech, půdách a odpadních kalech robustní metodu založenou na extrakci kapalinou za zvýšeného tlaku (PLE) s pyr-GC/MS. Autoři navrhnuli metodu tak, aby umožňovala měření nejběžnějších mikroplastů jako jsou polyethylen (PE), polypropylen (PP) a polystyren (PS) v relativně velkých objemech vzorků. V tomto aplikačním listu je popsaná metoda uplatněna s využitím sestavy Agilent 5977B GC/MSD, Agilent 7890 GC a softwarem MassHunter. GC/MSD stanovení bylo hodnoceno především z hlediska linearity, limitů kvantifikace (LOQ), reprodukovatelnosti a detekce a kvantifikace PE, PP a PS v reálných vzorcích životního prostředí. Kromě výše uvedených polymerů mohou být touto technikou dále stanoveny mikroplasty nylonu, polyuretanu (PUR), polyethylen tereftalátu (PET), ethylene-vinyl acetátu (EVA), polyvinyl chloridu (PVC), akrylonitril butadien styrenu (ABS) a mikroplasty polymerů obsahujících fluor.

Experimentální část

Příprava standardů a vzorků

Příprava kalibračních roztoků ze zásobního roztoku postupem ředění je vzhledem k nízké rozpustnosti PE a PP ve většině rozpouštědel prakticky nemožná. Přímé vážení velmi malých množství polymerů při přípravě kalibračních standardů nízkých koncentrací je zatíženo vysokým rizikem chyby, a též není vhodným postupem. Kalibrační roztoky byly z těchto důvodů připraveny metodou postupného ředění zásobní směsi s inertní matricí (kalcinovaný mořský písek). PE, PS (PSS polymer) a PP (Sigma-Aldrich) byly nejprve rozemlety v kryomlýnku a 250 mg od každého bylo následně smícháno s kalcinovaným mořským pískem, tak aby bylo získáno 10 g zásobní směsi. Takto získaná směs byla dále 20 min homogenizována v planetovém mlýnku. Zásobní směs byla dále ředěna, tj. 1 až 2 g byly smíchány s pískem tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace polymeru pro každý kalibrační bod od 0,005 do 10 mg/g. Směs byla homogenizována po každém ředícím kroku.

Příprava vzorku probíhala následovně. 1 g vzorku byl umístěn do 10 ml ocelové extrakční cely a byl extrahován v zařízení pro extrakci kapalinou za zvýšeného tlaku (PLE). Pro snížení matričních efektů byla začleněna před-extrakce methanolem. Vlastní extrakce mikroplastů probíhala při 185 °C a 100 bar pomocí tetrahydrofuranu. Extrakt byl sbírán do 60 ml viálek s 200 mg kalcinovaného silikagelu. Do každého vzorku bylo následně přidáno 10 µl polystyrenu-d5 (270 µg/ml dichlormethanu, Polymer Source), který slouží jako vnitřní standard. Rozpouštědlo bylo následně odpařeno a srážející se mikroplasty byly zachyceny na silikagelu. Mikroplasty ulpívající na stěnách viálky byly nejméně třikrát vypláchnuty dichlormethanem. Silikagel byl následně homogenizován po dobu 5 min.

Více detailů týkajících se přípravy standardů a vzorků najdete v článku Dierkes a kol (3).

Kalibrační vzorky, vzorky pro validaci metody (kromě vzorků pro testování velikosti částic), blanky (obsahující pouze písek) a reálné vzorky životního prostředí byly extrahovány stejným postupem.

Pyr-GC/MS analýza a instrumentální vybavení

Pyr-GC/MS analýza všech vzorků proběhla pomocí Multi-Shot Pyrolyzéru EGA/PY-3030D a Auto-Shot Sampleru AS-1020E (Frontier Laboratories) ve spojení s plynovým chromatografem 7890B a 5977B GC/MSD. Pro každou analýzu bylo použito 20 mg zhomogenizovaného silikagelu, který byl navážen do 80-µl pyrolyzního kelímku (Eco-Cup LF, Frontier Laboratories) a pyrolyzován při 600°C.

Plynový chromatograf 7890B byl vybaven kolonou HP-5ms UI se stacionární fází (5%-fenyl)-methylpolysiloxan (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, 19091S-433UI). Inertní provedení propojení plynového chromatografu a hmotnostního spektrometru Agilent zajišťuje vysokou výkonnost celé analýzy, a to především s ohledem na analyty nízkých koncentrací. Inertní povrch umožňuje rozšíření rozsahu jejich detekce a kvantifikace. Hmotnostní detektor 5977B GC/MSD byl dále vybaven extrakčním EI zdrojem a pro maximální citlivost byl zvolen a použit mód monitoringu vybraných iontů (SIM). Extrakční EI zdroj maximalizuje počet iontů, které jsou vytvořeny a následně z těla zdroje přeneseny do kvadrupólového analyzátoru a dále do detektoru. Celková doba GC/MS analýzy byla 29 min. Konfigurace GC/MS systému a podmínky vlastního měření jsou shrnuty v Tabulce 1 a 2.

HPST: Tabulka 1. Parametry plynového chromatografu Agilent 7890B

HPST: Tabulka 2. Parametry hmotnostního detektoru Agilent 5977B GC/MSD

Akviziční a kvantifikační metoda

Akvizice a zpracování dat bylo provedeno v softwaru MassHunter verze B.07.00. Pro produkty pyrolýzy každého polymeru byly měřeny vybrané ionty v módu SIM. Tyto jsou spolu s retenčními časy produktů pyrolýzy jednotlivých polymerů uvedeny v Tabulce 3. Sledované ionty byly následně použity pro kvantifikaci jednotlivých polymerů.

Kvantifikace byla provedena na základě kalibračních křivek 1/x sestrojených v softwaru MassHunter Quantitative.

HPST: Tabulka 3. Sledované ionty, retenční časy a sledované produkty pyrolýzy pro jednotlivé polymery

Zhodnocení a validace metody

Selektivita metody byla ověřena na základě extrakce a proměření matrice prosté mikroplastů, která byla smíchána s mořským pískem (3 hm. %). Testované matrice zahrnovaly třešňové dřevo, pupalkové listy, tisové jehličí, huminové kyseliny, filet z kapra, raka, motorový olej a filtrační papír. Tyto matrice obsahují proteiny, tuky a polysacharidy a jsou svým složením tudíž typické pro vzorky environmentálního původu.

Výtěžnost metody byla zjištěna na základě analýzy 1 g písku, který obsahoval 3 hm. % huminových kyselin uměle kontaminovaných 0,05 a 0.75 mg PE, PP a PS. Reprodukovatelnost metody byla ověřena opakovanou analýzou pěti vzorků životního prostředí, z nichž každý byl analyzován vícekrát. Vliv velikosti částic mikroplastů na reprodukovatelnost měření a minimální množství vzorku nutné pro získání reprezentativního alikvótu byly ověřeny analýzou směsi písku a PE dvou různých velikostí (10 až 50 µm a 200 až 400 µm), který byl kontaminována na dvou koncentračních hladinách (1 mg/g a 10 mg/g).

Zda je metoda vhodná pro testování reálných vzorků životního prostředí bylo ověřeno analýzou různých matric zahrnujících sedimenty, suspendovanou říční hmotu, substrát a odpadní kaly, které byly odebrány, usušeny a následně připraveny pro vlastní extrakci a analýzu. Od každé matrice bylo odebráno alespoň 500 g a byla analyzována alespoň ve třech opakováních postupem popsaným výše. Kontaminace vzorků z plastových nástrojů a nádobí byla pečlivě kontrolována.

Výsledky a diskuze

Linearita a limity kvantifikace

Chromatogram standardní směsi o koncentraci 0,25 mg/g je ukázán na Obrázku 1.

HPST: Obrázek 1. Extrahované iontové chromatogramy standardní směsi na hladině 0,25 mg/g

Pro vykreslení kalibračních křivek byly spočítány relativní plochy píků s využitím vnitřního standardu polystyrenu-d5. Lineární kalibrační křivky (R>0,97) až do 0,005 mg/g byly získány pro všechny polymery. Lineární odezva do 1 mg/g byla získána pro PP a PS. Pro PE byla odezva lineární až do 10 mg/g.

Velkým problémem v podobě rizika falešně pozitivní detekce při stanovení mikroplastů bývá hojný výskyt plastového spotřebního materiálu a plastových pomůcek ve většině laboratoří. Z tohoto důvodu autoři definovali LOQ jako koncentrace, na kterých bude mít 95 % slepých vzorků nižší odezvu než je dané LOQ. LOQ jako koncentrace polymerů ve slepých pokusech s jednostranným intervalem spolehlivosti (t*(ρ = 0.95; n-1 = 10)* = 1,812) byly vypočteny na základě průměrné relativní odezvy 11 slepých vzorků (viz Tabulka 4).

HPST: Tabulka 4. Limity kvantifikace

Selektivita metody

V dalším kroku byly stanoveny možné interference pocházející z matric nekontaminovaných vzorků životního prostředí, a to vzhledem k tomu, že kvantifikační metoda pro pyr-GC/MS stanovení je založena na nepřímé kvantifikaci produktů pyrolýzy jednotlivých polymerů (Tabulka 3). V testovaných matricích nebyly zjištěny žádné interference pro PP. Dřevo jako matrice, mělo za následek navýšení hodnoty pozadí pro PS, a to o 0,042 mg/g. Naopak rybí matrice bohatá na proteiny a v nich obsaženou aminokyselinu fenylalanin, která je při pyrolýze prekurzorem styrenu, ke vzniku interferencí nepřispěla. Proteiny byly totiž odstraněny během před-extrakce methanolem. Z výše uvedeného vyplývá, že kvantifikace PP a PS ve vzorcích životního prostředí založená na pyr-GC/MS by neměla být výrazněji ovlivněna přítomností přirozeně se vyskytujících látek. Výjimku představují matrice s vysokým podílem dřeva.

Naproti tomu kvantifikace PE interferencemi ovlivněna byla. Z 30 mg motorového oleje vznikly ionty, které intenzitou své odezvy přibližně odpovídaly standardu o koncentraci 1,1 mg PE. Tento výsledek poukazuje na problém, který může vzniknout při měření vzorků kontaminovaných olejem nebo benzínem. Souhrnem lze ale říci, že kroky před-extrakce methanolem a vlastní extrakce THF spolu s volbou indikátorových iontů pro kvantifikaci dohromady tvoří vysoce specifický analytický postup, vhodný pro kvantifikaci mikroplastů ve vzorcích s vysokým podílem organické hmoty.

Výtěžnost a reprodukovatelnost metody

V tabulce 5 jsou ukázány výtěžnosti PP, PS a PE v huminových kyselinách a mořském písku. Pokud uvažujeme statistickou odchylku ±20 %, matriční efekty nepředstavují žádné problémy. Výtěžnosti v ostatních organických vzorcích jako jsou rybí filet, rak, listy a jehličí, byly obdobné. Relativní směrodatné odchylky (RSD) byly 10 % a nižší, což ukazuje na výbornou reprodukovatelnost a spolehlivost metody.

HPST: Tabulka 5. Výtěžnosti pro jednotlivé polymery a hladiny umělé kontaminace

Vzhledem k tomu, že přímá (tj. bez extrakce) analýza pyr-GC/MS 20 mg vzorku, což je maximální množství, které lze umístit do 80 µL pyrolyzního kelímku, vedla k vysokým hodnotám RSD, a to až 50 %, bylo zvýšeno množství vzorku pro PLE s tetrahydrofuranem, a to až na 1000 mg. Při použití 200 mg frakce 10 až 50 µm byly RSD do 10 %, zatímco pro frakce 200 až 400 µm i při použití většího množství 1000 mg bylo RSD 21 %. Tyto výsledky ukazují, že vzorky s obsahem částic mikroplastů větších než 200 µm by měly být před vlastní extrakci PLE rozemlety v kryomlýnku, aby bylo dosaženo homogenního rozložení částic.

Analýza vzorků životního prostředí

Kontaminace PP, PE a PS byla zjišťována ve vzorcích sedimentů, suspendovaných částic a odpadních kalů. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v Tabulce 6. Bylo zjištěno následující:

• Ve vzorcích říčních sedimentů byly detekovány PP a PE na hladinách 0,032 ± 0,001 a 0,028 ± 0,006 mg/g, respektive, zatímco PS nepřekročil hladinu LOQ (0,008 mg/g). PE a PP byly detekovány v suspendované hmotě na hladinách 0,98 ± 0,02 a 0,055 ± 0,010 mg/g, respektive.

• V odpadních kalech byly všechny tři polymery detekovány na koncentracích v rozmezí od 0,08 ± 0,02 mg/g (PP) do 3,3 ± 0,3 mg/g (PE).

• Substrát obsahoval PE na koncentračních hladinách podobných jako v odpadních kalech, u PP byla zjištěna pouze stopová množství a PS nebyl detekován.

• V půdě vzorkované v okolí silnic byly všechny tři polymery zjištěny na hladinách dosahujících až 0,85 ± 0,07 mg/g (PE).

Tyto výsledky potvrzují, že GC/MSD 5977B je vhodný pro detekci a kvantifikaci mikroplastů PE, PP a PS technikou pyr-GC/MS z různých typů matric.

HPST: Tabulka 6. Výsledky analýzy vzorků životního prostředí

Závěr

Předložený aplikační list dokazuje, že Agilent 5977B GC/MSD ve spojení s Agilent 7890 GC a softwarem MassHunter představuje efektivní řešení pro rutinní, robustní a spolehlivou kvantifikaci mikroplastů ve vzorcích životního prostředí s využitím metody pyr-GC/MS popsané v publikaci Dierkes a spol (3).

Využitím techniky GC/MSD byl především adresován nedostatek ostatních uplatňovaných analytických metod, jímž jsou nedostatečné limity detekce.

Mikroplasty PE, PP a PS byly úspěšně kvantifikovány na nízkých koncentracích (až do 0,005 mg/g) v testovaných matricích i v reálných vzorcích životního prostředí. Pro všechny tři analyty bylo dosaženo výborné linearity (R2>0,97) pro kalibrační vzorky od 0,005 do 1 mg/g. Pro PE byla odezva lineární až do 10 mg/g. Relativní směrodatná odchylka (RSD) do 10 % byla dosažena jak pro uměle kontaminované, tak pro reálné vzorky, což představuje excelentní reprodukovatelnost a spolehlivost celé metody.