Analýza dioxinů v potravinách a krmivech pomocí Shimadzu GC-MS/MS s BEIS

Perzistentní organické znečišťující látky (POPs) jsou v potravinách a krmivech pro zvířata analyzovány různými metodami. Z řady POPs mají zejména dioxiny vysokou toxicitu, proto je nezbytná jejich kvantitativní analýza při nízkých koncentracích.

Doposud se při analýze dioxinů používala magnetická sektorová (dvojitě fokusovaná) GC-MS (GC HRMS), která poskytuje vysokou přesnost kvantitativní analýzy. Protože se však výkon kvantitativní analýzy pomocí GC-MS na bázi trojitého kvadrupólu (dále GC-MS/MS) v poslední době výrazně zlepšil, EU vydala nařízení Komise (EU) 589/2014 a 644/2017, kterým stanovila analytické metody pomocí GC-MS/MS jako oficiální zkušební metody na stejné úrovni jako metody pomocí GC-HRMS. Z tohoto důvodu vzbudila zájem analýza dioxinů pomocí GC MS/MS.

Při ionizaci metodou EI je v této aplikaci využíván iontový zdroj Boost Efficiency Ion Source (BEIS), který maximalizuje účinnost ionizace pomocí optimalizace ohniska elektronového paprsku. BEIS tak dosahuje přibližně čtyřikrát vyšší citlivosti než konvenční iontové zdroje.

V tomto článku byly analyzovány dioxiny v asi 250 vzorcích z přibližně 40 druhů potravin a krmiv za použití GC-MS/MS s BEIS. (Dioxiny však byly omezeny na polychlorované dibenzo-p-dioxiny (PCDD) a polychlorované dibenzofurany (PCDF).) Byl vyhodnocen výkon kvantitativní analýzy porovnáním výsledků analýz získaných pomocí GC-HRMS a GC MS/MS. Rovněž byl vyhodnocen počet analýz při zachování požadované citlivosti na nízkých koncentracích za účelem ověření stability a robustnosti GC-QQQ přístroje.

Příprava vzorků a podmínky analýzy

Všechny vzorky potravin a krmiv byly připraveny pomocí automatického zařízení pro úpravu vzorků (extrakce: SpeedExtractor (BÜCHI Labortechnik AG), čištění vzorku: GO-xHT (Miura Co., Ltd.)).

Jako konečné rozpouštědlo vzorků byl použit Nonan a konečný objem rozpouštědla byl 10 μl. Vzorky standardů byly připraveny mícháním DF-ST a DF-LCS (Wellington Laboratories Inc.).

Byly použity podmínky GC-QQQ analýzy, které jsou v souladu s podmínkami GC-MS/MS analýzy v registrovaných předpisech EU, jež splňuje balíček metod GC-MS/MS pro dioxiny v potravinách „GC-MS/MS Method Package for Dioxins in Foods“.

Tabulka 1: Podmínky GC-MS/MS analýzy

Výsledky analýz vzorků standardů

Stejně jako rozsah koncentrací kalibrační křivky byly připraveny také vzorky standardů v rozmezí koncentrací od 0,025 pg/μl do 1 pg/μl (dvojnásobná koncentrace pro Octa-PCDD/PCDF). V předpisech EU musí všechny sloučeniny splňovat dvě níže uvedená kritéria (částečně vyjmuta z EU 589/2014 a 644/2017) pro limit kvantitativní analýzy (LOQ). Tato studie potvrdila, že obě kritéria lze splnit v nejnižším bodě kalibrační křivky. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.

1. Poměr S/N

Koncentrace analytu v extraktu vzorku, který produkuje instrumentální odezvu na dvou různých iontech, je monitorován s poměrem S/N (signál/šumu) 3: 1 pro méně intenzivní signál v surových datech.

Pokud z technických důvodů výpočet signálu k šumu neposkytuje spolehlivé výsledy:

2. Nejnižší bod koncentrace na kalibrační křivce

Nejnižší bod koncentrace na kalibrační křivce dává přijatelnou (≤30%) a konzistentní (měřeno alespoň na začátku a na konci analytické série vzorků) odchylku od faktoru průměrné relativní odezvy (average RRF z ang. relative response factor), vypočteného pro všechny body na kalibrační křivce v každé sérii vzorků.

Tabulka 2: Vyhodnocení výsledků LOQ pro analýzu vzorků standardů

Obrázek 1: Chromatogramy reprezentativních sloučenin při analýze vzorků standardů (koncentrace: 0,025 pg/μl)

Vyhodnocení citlivosti pro analýzu reálných vzorků

Byla ověřena citlivost na nízké koncentraci při analýze skutečných vzorků. Obr. 2 ukazuje chromatogramy reprezentativních sloučenin. Při analýze reálných vzorků byla získaná také uspokojivá citlivost blízko limitu kvantifikace (LOQ).

Obrázek 2: Chromatogramy reprezentativních sloučenin při analýze reálných vzorků

Vyhodnocení přesnosti kvantifikace v analýze skutečných vzorků

Bylo analyzováno více než 250 vzorků přibližně 40 druhů potravin a krmiv pro zvířata pomocí GC-MS/MS. Přesnost kvantifikace GC-MS/MS byla hodnocena pomocí analýzy stejných GC-MS/MS vzorků s GC-HRMS a porovnání výsledků. Výsledky byly porovnány převodem kvantitativních hodnot každého vzorku na TEQ (Ekvivalentní množství toxicity). Výsledky jsou uvedeny na Obr. 3.

Obrázek 3: Porovnání kvantativních hodnot GC-MS/MS a GC-HRMS (vlevo: lineární stupnice, vpravo: logaritmická stupnice)

Vlevo na Obr. 3 je vodorovná a svislá osa zobrazena lineárními stupnicemi. Na obrázku vpravo jsou použity logaritmické stupnice, aby bylo možné podrobně potvrdit výsledky vzorků s malými kvantitativními hodnotami. Oba obrázky ukazují kvantitativní hodnoty pomocí GC-HRMS na horizontální ose a provedené GC-MS/MS na vertikální ose. Na obou obrázcích, při existenci korelace hodnot GC-HRMS a GC-MS/MS, jsou hodnoty směrnice přímky blízké 1 (modrá přerušovaná čára).

Na Obr.3 vlevo jsou kvantitativní hodnoty pomocí GC-MS/MS a GC-HRMS podobné ve všech vzorcích, ve kterých byly kvantitativní hodnoty detekovány na úrovni 1 ng/kgTEQ nebo více.

Na obrázku vpravo jsou čáry (oranžové přerušované čáry), kde byl poměr kvantitativních hodnot pomocí GC-MS/MS a GC-HRMS 50 % nebo 200 % jako standard pro rozdíl mezi kvantitativními hodnotami získanými dvěma metodami.

Ve vzorcích, kde kvantitativní hodnota pomocí GC-HRMS byla 0,1 ng/kgTEQ nebo méně, byly pozorovány některé rozptýlené výsledky s poměrem kvantitativních hodnot mimo rozmezí 50–200 %.

Vzorek s nejmenší maximální přípustnou úrovní (ML) byl vepřový tuk s ML 1,0 ng/kgTEQ. Velký rozdíl v kvantitativních hodnotách (tj. kvantitativní hodnota poměru mimo rozsah 50 % až 200 %) je možný při úrovni koncentrace nejméně 10krát nižší než ML. Nicméně v kvantifikaci nebyl vidět žádný významný rozdíl ve výkonu GC-MS/MS a GC-HRMS při koncentraci požadované v analýze.

Vyhodnocení stability při analýze skutečných vzorků

Jako hodnocení spolehlivosti a robustnosti při analýze dioxinů v potravinách, byly analyzovány střídavě skutečné vzorky a standardní vzorky (koncentrace: 0,05 pg/μl). Dále byl vyhodnocen počet možných analýz při zachování citlivosti na základě stability citlivosti na nízkých koncentračních hladinách standardních vzorků. Celkem bylo provedeno více než 500 analýz standardní a reálných vzorků. Obr. 4 ukazuje výsledky.

Obrázek 4: Stabilita Peak area (plochy píků) při opakovaných analýzách

Na Obr. 4 zobrazuje vodorovná osa počet analýz a svislá osa ukazuje plochu píku u každého čísla analýzy. Po více než 500 analýzách nedošlo k žádnému velkému poklesu citlivosti analýzy. Dále Tabulka 3 ukazuje průměrnou plochu píku a opakovatelnost od 1. do 530. analýzy. Opakovatelnost byla menší než 20 % RSD pro všechny sloučeniny, což naznačuje, že tuto citlivost lze udržovat během celého testu.

Tabulka 3: Průměrná Peak area (plocha píků) a opakovatelnost pro vzorky standardů (koncentrace: 0,05 pg/μl) v testu robustnosti a spolehlivosti

Závěr

V tomto experimentu byly analyzovány dioxiny ve více než 250 vzorcích přibližně 40 druhů potravin a krmiv pomocí GC-MS/MS s BEIS a byla vyhodnocena kvantitativní výkonnost GC-MS/MS tak, že se porovnaly výsledky analýz GC-MS/MS a GC-HRMS. Na základě tohoto hodnocení nebyl zjištěn rozdíl v kvantitativním výkonu GC-MS/MS a GC-HRMS na úrovni koncentrace nezbytné při těchto analýzách. Byla hodnocena také robustnost a spolehlivost analýzy při analýze dioxinů ve skutečných vzorcích a nedošlo k poklesu citlivosti při nízké koncentraci ani po více než 500 analýzách. Na základě těchto výsledků jsme zjistili, že BEIS má vysokou citlivost pro dioxiny a také umožňuje analýzu s vysokou životností.

Poděkování

Rádi bychom při této příležitosti vyjádřili upřímné poděkování do Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Alimenty pro spolupráci při poskytování vzorků, vedení a další pomoc při přípravě této práce.