Identifikace terpenů rostlin rodu cannabis v ovzduší

V současné době dochází k nárůstu pěstíren konopí, které jsou velmi obtížně odhalovány. Při pěstování konopí dochází k uvolňování terpenů do ovzduší, které vytvářejí charakteristický zápach pro tyto rostliny. V těchto případech lze provést odběr vzorků vzduchu z přípustné vzdálenosti od místa pěstování. Vhodnou metodou pro odběr vzorků z ovzduší je technika termální desorpce, kdy vzorek je odebrán na sorpční trubičku a následně analyzován v laboratoři na plynovém chromatografu s hmotnostním detektorem. Pomocí této techniky byly identifikovány charakteristické monoterpeny, které prokázaly přítomnost pěstírny konopí v daném objektu.

PĚSTÍRNY KONOPÍ

Podle výroční zprávy Národní protidrogové centrály za rok 2019, dochází nadále k nárůstu malých pěstebních provozů jak ve vnitřním, tak i venkovním prostředí. Celkový počet zajištěných pěstíren v posledních 7 letech zůstává prakticky neměnný (1). Většina pěstíren je odhalena na základě černého odběru elektrické energie (2). U malých pěstíren je ale tato spotřeba nedostatečným důkazem k získání příkazu k domovní prohlídce.

HZS: Tabulka I: Vývoj zajištěného množství v letech 2009 - 2019 (1)

HZS: Obr. 2. Poměr zajištěných pěstíren marihuany - 2011 - 2019 - dle velikosti (v %) (1)

HZS: Obr. 3. Počet zajištěných pěstíren v ČR v letech 2002 - 2019 celkem (1)

TERPENY

Při pěstování konopí dochází k uvolňování těkavých látek do ovzduší. Jedná se o terpeny, které vytvářejí intenzivní a charakteristický zápach pro tyto rostliny. Někteří autoři popisují, že do ovzduší se uvolňuje až okolo 200 látek, jedná se především o monoterpeny, případně seskviterpeny (4, 5, 6). Společně pak tyto látky můžou být identifikačním znakem přítomnosti rostlin rodu Cannabis v daném místě. Stále důmyslnější zabezpečení objektů a zejména dodržování práva domovní svobody, znemožňuje odběr vzorků přímo z interiéru objektů, nebo jejich bezprostřední blízkosti. V těchto případech je jedinou možností odběr vzorků vzduchu z přípustné vzdálenosti od objektu, obvykle se jedná o jednotky až desítky metrů. Terpeny uvolňované do ovzduší jsou senzoricky cítit již ve velmi malé koncentraci. Literární zdroje uvádějí obvykle koncentrace okolo 0,1 ppm (7, 8).

Základem biosyntézy terpenů a kanabinoidů v konopí představují 5-uhlíkové izoprenoidové stavební bloky isopententyl difosfát (IPP) a dimethylallyl difosfát (DMAPP), které jsou kondenzovány za vzniku geranyl difosfátu (GPP) (C10) nebo farnesyl difosfátu (FPP) (C15). Terpenové syntázy (TPS) převádějí GPP nebo FPP na terpeny. Aromatické prenyltransferázy (aPT) kondenzují GPP s kyselinou olivetolovou za vzniku kyseliny kanabigerolové (CBGA), která je cyklizována kanabinoidními syntázami za vzniku kanabinoidů (5).

Terpenové složení je fenotypová vlastnost, která vykazuje určité rozdíly mezi různými „konopnými“ kmeny konopí. Většina terpenů nalezených v konopí jsou uhlovodíky, které jsou přímými produkty enzymů terpenové syntázy (TPS), na rozdíl od složitějších terpenů, které vyžadují modifikaci jinými enzymy, jako jsou cytochrom P450. Proto chemická rozmanitost konopných terpenů odráží rozmanitost enzymů TPS kódovaných v genové rodině konopných TPS. (5) Terpenové složení konopné pryskyřice se podstatně liší v závislosti na genetických, environmentálních a vývojových faktorech. (4, 9).

Naši zájmovou skupinou látek jsou v tomto případě monoterpeny. Autoři Booth a Bohlmann uvádějí dvanáct základní monoterpenů. Jedná se o: β-pinen, α-pinen, β-thujon, 3-karen, terpinolen, limonen, terpineol, 1,8-cineol, α-terpinen, linalool, myrcen a (Z) -β-ocimen (5). Pří extrakci terpenů zjistil Booth, Page a Bohlmann, že nezávisle na fázi květenství byly nejhojnějšími monoterpeny a-pinen, limonen, β-pinen, terpinolen a (E)-β-ocimen (6). Další zdroj uvádí z 13 monoterpenů a 14 seskviterpenů 5 nejčastějších, a to monoterpeny myrcen, terpinolen, α-pinen, β- a limonen a jeden seskviterpen caryophyllen (9). U sušených rostlin koncentrace monoterpenů klesá. Bylo prokázáno, že na základě přítomnosti 5,5-dimethyl-1-vinylbicyklo(2.1.1)hexanu lze rozlišit hašiš od čerstvých a sušených rostlin. Tato látka vzniká z β-myrcenu při UV záření (4).

Nedávné studie udávají, že C. indica obsahuje o 60-80% více myrcenu než C. sativa. Myrcen se tak stává dominantním terpenem přítomným v rostlinách rodu Cannabis (10).

α-pinen a β-pinen jsou další podstatné terpeny pro identifikaci. Ze všech terpenu přítomných v rostlinnách rodu Cannabis představují 10- 20 % celkového obsahu. Jejich prioritou je jejich těkavost, proto v chromatografech často vykazují dominantní píky. Pineny jsou základní složkou jehličnanů, proto při vzorkování musíme dodržet dostatečný odstup od těchto dřevin, případně analýzu doplnit dalším srovnávacím vzorkem (10).

d-limonen je druhým nejhojnějším terpenem v konopí. Zároveň je však docela hojně využíván jako vonná látka do různých kosmetických a čistících prostředku. V přírodě je součásti citrusových plodů. Tyto fakta musíme rovněž zohlednit při vzorkování. (10, 11).

Linalol je terpen, který má největší podíl na charakteristické vůni konopí (11).

Eukalyptol, karen, felandren a terpinolen jsou důležité terpeny, jelikož odborné studie poukazují, že se vyskytují téměř výhradně u odrůd sativa (10).

Karyofylen patří do skupiny seskviterpenů, je však z této skupiny nejtěkavější a proto i za vhodných podmínek detekovatelný v ovzduší. Jeho předností je, že nepodléhá dekarboxylaci, a je tak nejsnadněji nalezitelnou složkou v extraktech konopí (10).

METODIKA ANALÝZY TERPENŮ V OVZDUŠÍ

Z dosavadních analýz vyplývá, že senzorická identifikace je jakýmsi limitním množstvím pro odběr vzorků vzduchu a následnou analýzu. Měření tak nízkých koncentrací pomocí PID detektoru se v praxi moc neosvědčilo, zejména z důvodu rušivých vlivů ostatních těkavých látek z okolí. Senzorický zápach je však natolik specifický, že je pro následné vzorkování nepostradatelný. Využití čichu služebních psů je problematické, jelikož jsou cvičení na suchý rostlinný materiál, nebo hašiš. U těchto vzorků je potlačena koncentrace monoterpenů. Navíc služební psi jsou cvičení na vyhledání konkrétního místa výskytu dané látky (výbušniny, drogy, akceleranty, apod.). Všudy přítomný zápach v ovzduší vyvolává u psů dezorientaci a znesnadňuje určení zdroje.

Pro odběr vzorků z ovzduší se nejlépe osvědčila technika termální desorpce, kdy na sorpční trubičku je odebírán vzorek ovzduší a následně analyzován v laboratoři na plynovém chromatografu s hmotnostním detektorem. Vzorkování lze provádět pasivně i aktivně. Pasivní vzorkování se ovšem moc neosvědčilo v exteriéru. V případě aktivního vzorkování byl požíván průtok do 500 ml/min a dobou vzorkování 30 - 60 minut. Kratší doba vzorkování může být nedostatečná pro identifikaci sledovaných terpenů. Delší doba zase naopak není příliš efektivní z důvodu sorpce ostatních těkavých látek z okolí. Jako náplň sorpční trubičky se osvědčily kombinované sorbenty (slabý a silný), v našem případě Tenax TA 35/60 (100 mg) + Carbograph 5TD 40/60 (100 mg). Analýzu může významně narušit přítomnost pevných částic (pylu, prachu) zachycených na sorpční trubičce, které při termální desorpci produkují za nepřítomnosti kyslíku řadu produktu termodegradace a výrazně stěžují identifikaci sledovaných terpenů. K tomuto účelu je vhodné při vzorkování používat vhodné předfiltry.

Odběr vzorků

V praxi se neosvědčilo odebírat vzorky pomocí druhé osoby, ani po důkladném zaškolení, jelikož počty špatně odebraných vzorků byly příliš vysoké. Nejčastější příčinou byla kontaminace sorpční trubičky a znehodnocení daného vzorku. Při vzorkování nízkých koncentrací z exteriéru je potřeba klást důraz na preciznost a čistotu. Trubičky by měly být připraveny a kondiciovány krátce před analýzou a těsně uzavřeny v dvojobalu. Při transportu na místo zájmu a zpět musí byt zajištěno, aby nepřišly sorpční trubičky do kontaktu s jinou těkavou látkou, ve vozidlech jsou to nejčastěji pohonné hmoty. Manipulace by měla být prováděná v rukavicích.

Před samotným odběrem je potřeba znát meteorologickou situaci. Vždy je výhodnější odebírat vzorek za vyšší okolní teploty, kdy dochází k lepšímu odpařování terpenu. Důležitým faktorem je směr větru. Vzorky odebíráme na závětrné straně, často v úzkém pásu šíření. Je potřeba se vyvarovat místům s možnou přítomností přírodních terpenů (květiny, kvetoucí keře a stromy, jehličnany, apod.) Sorpce by neměla být prováděna na vyvýšeném místě, pokud možno ne přímo na zemi z důvodu zvýšené přítomnosti prachu, pylu apod.

Obdobným způsobem je vhodné odebrat kontrolní (srovnávací) vzorek na návětrné straně, případně tam, kde to situace dovoluje, musí být ovšem zajištěna dostatečná vzdálenost od místa s očekávaným výskytem terpenů.

Mnohdy je zapotřebí odhlučnit čerpadlo a zakrýt světelné zdroje z důvodu možného prozrazení. Je vhodné vždy provádět odběr min. dvou vzorků. Výhodné je tento odběr provádět současně a minimalizovat tak přítomnost na daném místě.

Po ukončení vzorkování je potřeba sorpční trubičky těsně uzavřít do čistého dvojobalu a co nejrychleji je transportovat do laboratoře k následné analýze.

Analýza vzorků

Pro analýzu terpenů byly využity poznatky jiných autorů, kteří se zabývali obdobným tématem (12, 13, 14, 15, 16, 17).

Před samotnou analýzou bychom již měli mít k dispozici vlastní chromatogramy standardů terpenů. V našem případě se jednalo o standardy RESTEK (18). Nedoporučujeme analyzovat standard těsně před analýzou, aby případné rezidua nezpůsobily falešné výsledky.

Termální desorpce by měla být připravena již před samotným odběrem vzorků, tzn. v čase kondicionace sorpčních trubiček. Je zapotřebí vyhřát všechny větve včetně „ColdTrap“ a zbavit se tak případných nečistot.

Před zahájením analýz můžeme ještě provést kontrolu citlivosti na daný standard. Nemělo by se ale jednat o sledované terpeny. Následně lze provést kontrolu čistoty systému.

HZS: Tabulka II Cannabis Terpenes Standard #1 & #2, kolona Rxi-624Sil MS (18)

HZS: Obr. 4 Cannabis Terpenes Standard #1 & #2, kolona Rxi-624Sil MS, nástřik, FID (18)

Analýza vzorků musí být provedena pokud možno ihned, aby nedošlo k případnému znehodnocení (kontaminaci). Nastavení splitovacího poměru pro primární a sekundární desorpci, případně v nástřikovém modulu, je vhodné nastavit na nižší hodnoty. V našem případě se jednalo o celkový split 1:50 (viz Obr. 6).

Ještě před zahájením provedeme analýzu kontrolního vzorku, abychom definitivně vyloučili případnou kontaminaci při vzorkování, přepravě, nebo samotné analýze.

Před analýzou vzorků je nutné mít připravenou čistou splitovací trubičku, pro případ neúspěšné analýzy a následné opakování.

Interpretace

Přestože provedeme analýzu maximálně pečlivě, lze očekávat, že ve vzorku bude vysoké pozadí, tzn. píky těkavých látek, které se vyskytují v místě odběru ve vzduchu, případně vznikly termodegradaci zachycených pevných částic, nebo došlo ke kontaminaci trubičky. Vzniklá chromatogram musíme proto extrahovat na iontu m/z 93 (viz Obr. 5 a 6)., který je typický pro všechny monoterpeny. Případně můžeme použít i m/z XZ, který je typický pro seskviterpeny. Při procesování je nutné zvolit správné nastavení jednotlivých parametrů, které nám můžou výrazně ovlivnit výsledky. Důležitým krokem je použití dekonvoluce. K tomuto účelu se dobře osvědčily zejména hmotnostní spektrometry a analyzátorem „Time of Flight„

HZS: Obr. 5 Chromatogram STD Restek, SPME

Nalezené terpeny identifikujeme pomocí hmotnostního spektra a NIST knihovny. Zároveň je důležité srovnávat retenční časy se standardy. U některých malých píků může dojít k špatnému vyhodnocení. Jedna se obvykle o méně těkavější terpeny. Přítomnost iontu m/z 93 a shodného retenčního času nám může pomoct odhalit pravděpodobný přítomnost dalších terpenů.

HZS: Obr. 6 Chromatogram reálného vzorku

Množství identifikovaných terpenů je zásadní pro výsledné potvrzení či vyvrácení přítomnosti rostlin rodu Cannabis. Počet těchto terpenu nebyl z našich analýz zatím přesně stanoven, přesto je patrné, že potvrdit minimálně 5 hlavních terpenů by nemělo činit problém a tento počet již s vysokou pravděpodobností potvrzuje přítomnost konopí.

Závěr

Analýzou vzorku vzduchu pomocí termální desorpce a plynové chromatografie z hmotním detektorem lze identifikovat rostliny rodu Cannabis v okolí jejich výskytu. Při vzorkování a následní analýze je potřeba dodržet přesný metodický postup. Jako hlavní terpeny byly pro identifikaci zvoleny monoterpeny alpha-pinen, kamfen, (-)-beta-pinen, beta-myrcen, delta-3-caren, d-limonen, ocimen, terpinolen, linalool, eukalyptol a jeden seskviterpen beta-karyofyllen. Úspěšnou identifikaci těchto terpenů v ovzduší lze s velkou pravděpodobností prokázat přítomnost rostlin rodu Cannabis nebo produkty zpracování těchto rostlin, v daném místě, případně konopí bez nutnosti vstupu do objektu a na pozemky v soukromém vlastnictví.

Metodika byla vypracována za účelem doplnění, usnadnění a urychlení získávání operativních informací pro účely Policie České republiky v souvislosti s nedovolenou výrobou a nakládáním s omamnými a psychotropními látkami.