GC kolony - instalace a výměna (2. část)

Pokračování článku GC kolony - instalace a výměna (1. část)…

Dále položíme volný konec kolony (detektorový konec) do malé vialky s vodou, hexanem nebo jiným vhodným rozpouštědlem a měli bychom pozorovat rovnoměrný proud bublinek. Pokud nevidíte bublinky, bude třeba zkontrolovat zdroj nosného plynu, průtok plynu inletem a další nastavení GC, zda někde nedochází k úniku. Jakmile vidíte bublinky, vše je v pořádku. Po kontrole opět očistíme konec kolony od zbytků rozpouštědla acetonem či metanolem napuštěným hadříkem.

Jako nosný plyn doporučujeme používat vysoce čistý vodík nebo helium. Dříve se často používal i dusík, ale u většiny aplikací se v poslední době již nedoporučuje. Ať už používáte kterýkoliv nosný plyn, doporučujeme minimální čistotu 99,995 %. Nejčastější nečistotou bývá kyslík a jeho přítomnosti je třeba se vyhnout. V nosném plynu by ho mělo být méně než 1 ppm, neboť může při zahřátí ničit kolony systému.

Při nainstalování kolony do detektoru budeme postupovat stejně, jako tomu bylo v případě inletové strany. Na konci kolony už máme nasunuté septum, matičku i ferulku, kolonu jsme seříznuli čistým řezem a nyní konec jednoduše jen zasuneme do detektoru. Na doraz a pak malinko povytáhnout.

HPST: Instalace GC kolony - meření správné vzdálenosti

Měli bychom také zkontrolovat, zda vše těsní. K tomu můžete použít elektronický detektor netěsností. Zkontrolujte oba body propojení, jak prostor na vstupu do inletu, tak prostor na vstupu do detektoru. Elektronická kontrola tlaku umožňuje snižovat či zvyšovat lineární rychlost nebo průtok nosného plynu systémem. Je stěžejní, abyste do softwaru na počítači (OpenLab), nebo pomocí GC klávesnice či dotykového displeje zadali správné parametry kolony, aby bylo možné následně nastavit odpovídající hodnoty rychlosti a průtoku nosného plynu. Vždy se podívejte do souhrnného přehledu vlastností kolony, který bývá součástí balení, abyste zadali přesnou hodnotu vnitřního průměru kolony.

Nyní přichází vhodná chvíle pro nástřik vaší testovací směsi, nebo kontrolního standardu pro ověření nastavení GC. Tento vzorek obsahuje látku nebo více látek o známých retenčních časech, které nám následně ověří, že nastavení GC je správné. Samozřejmě očekáváme i ostré píky, které jsou pak dalším potvrzením úspěšné instalace kolony.

Lineární rychlost nosného plynu můžeme ověřit nástřikem látky, která není na koloně zadržována. Začneme s nastavením teploty pece na přibližně 35 až 40 °C. Nyní provedeme nástřik 1 až 2 μl nezadržované látky při nastavení S/SL inletu do módu split. Pokud máte na GC pouze megabore direct, on-column, nebo splitless injektor, které vám neumožňují splitovat zplyňený objem vzorku v inletu, zřeďte vzorek před nástřikem o něco více, aby vám nezahltil detektor. Většina laboratoří k tomuto účelu využívá metan, ale dobrým trikem, který se také vidí často, je butanový zapalovač na cigarety. Je snadno dostupný a vše, co potřebujete, je přece pouze trocha plynu. Dejte pozor, abyste při natahování do jehly neškrtnuli a natáhněte 1 či 2 μL. Následně nastříkněte do inletu, spusťte GC analýzu a na chromatogramu hledejte velmi ostrý, symetrický pík. Při splitless nástřiku můžeme pozorovat mírný jev chvostování píku. Pokud se na chromatogramu neobjeví žádný pík, je možné, že nosný plyn neprotéká systémem. Zkontrolujte regulátory průtoku, zdroj nosného plynu a ovladače průtoku, zda je vše patřičně nastaveno. Ujistěte se, že správně pracuje detektor, záznam signálu i jehla stříkačky. Pokud vám kolonou nezadržovaná látka chvostuje, je možné že dochází k úniku nosného plynu v prostoru inletu, špatně jste připojili kolonu, nebo nastavili příliš nízký splitovací poměr. Přeinstalujte kolonu, zkontrolujte nastavení a zkontrolujte také inlet na netěsnosti. Než budete pokračovat, potřebujete zaznamenat symetrický pík.

HPST: Nástřik nezadržované látky pro kontrolu cesty vzorku

Nyní kondicionujeme kolonu. Zahřátím kolony bez průtoku nosného plynu nebo za přítomnosti kyslíku v nosném plynu kolonu zničíme. Nejprve se ujistěte, že veškerý kyslík byl z kolony vytlačen. Za tímto účelem kolonu proplachujte zhruba 15 minut nosným plynem. Následně kolonu zahřejte na její horní teplotní limit, nebo 10 až 20 °C nad nejvyšší operační teplotu vámi používané metody. Z těchto dvou možností vyberte nižší variantu maxima. Nepřekračujte maximální teplotní limit kolony, jinak jí poškodíte. Rychlost ohřevu není stěžejní, ale absence kyslíku a plně těsnící systém jsou nutností. Během kondicionace kolony pozorujte baseline. Můžete vidět určité artefakty, píky nečistot zanesených během instalačního procesu, ale tyto by neměly v systému přetrvávat. Po tom, co kolona dosáhne kondicionační teploty, sledujte chování baseline. Pokud roste spolu s rostoucí teplotou systému, opět zkontrolujte systém na netěsnosti. Pokud vyroste a vrátí se na základní úroveň, možná jste právě vymyli nějakou nečistotu o vysoké molekulové hmotnosti, která se do kolony dostala během instalace. Ideální odezvou je plochá baseline. Této odezvy byste měli dosáhnout poměrně brzy, v závislosti na kondici instrumentu, ve které se nacházel v momentě instalace. Můžete být hotovi do 15 minut, ale někdy vše trvá třeba až 60 minut od momentu dosažení kondicionační teploty. Pokud se baseline neustálí do 2 až 3 hodin a není konstantní, ukončete kondicionaci. Nestabilní baseline může být důsledkem netěsnosti kdekoliv na trase nosného plynu, nejen v prostoru inletu a může být také zapříčiněna kontaminací systému. Nejlepším řešením, než budete pokračovat, je pochopitelně zchladit systém a najít a odstranit příčinu.

HPST: Baseline a šum

Polární stacionární fáze a kolony o větších průměrech (tzv. wide bore) obvykle vyžadují delší stabilizační časy než kolony s menším průměrem (tzv. narrow bore) a nepolární stacionární fáze. PLOT kolony (porous layer open tubular) vyžadují speciální kondicionační procedury. U těchto kolon opět vždy postupujte podle souhrnného přehledu vlastností kolony. Zde byste vždy měli najít vhodný postup.

Co se týká Plynových chromatogafů s ECD detektorem a hmotnostních (MS) detektorů, někteří analytici mají za to, že ke kondicionaci kolony dojde rychleji když kolona během procesu není připojena k detektoru. Tímto postupem se však nedozvíte nic o stabilitě baseline, nebo netěsnostech systému. Pokud budete kondicionovat kolonu při netěsnosti v systému, způsobíte její nevratné poškození, které povede k vysoké krvácivosti stacionární fáze nebo k jejímu aktivování a následné ztrátě inertnosti. Pokud je kolona kondicionována, přičemž detektorový konec je odpojen, doporučujeme konec následně zkrátit, protože mohlo dojít k jeho poškození. Odstřihněte 10 až 20 cm volného konce kolony, než jej připojíte do detektoru.

U kapilárních GC kolon je průměrná lineární rychlost mnohem spolehlivějším a lepším měřítkem pohybu nosného plynu než objemový průtok. Rychlost hovoří pouze o rychlosti plynu, takže nepotřebujeme znát vnitřní objem kolony nebo její vnitřní průměr. Viskozita nosného plynu je závislá na teplotě prostředí, a proto při různých teplotách potřebujete různé tlaky, abyste dosáhli stejné průměrné lineární rychlosti nosného plynu. Proto nastavujte průměrnou lineární rychlost nosného plynu dané analýzy vždy při stejné teplotě. Touto teplotou pak většinou bývá počáteční teplota pece. Pokud chcete, můžete si průměrnou lineární rychlost vypočítat sami při nástřiku 1 až 2 μL kolonou nezadržované látky, jak jsme nastínili dříve, s následným vsazením retenčního času píku do následující rovnice. Vstupní tlak upravujte tak dlouho, dokud nedostanete patřičnou průměrnou lineární rychlost nosného plynu. U plynových chromatografů s elektronickou kontrolou tlaku můžete lineární rychlost nosného plynu zadat na počítači nebo přímo na klávesnici/displeji chromatografu. Jak jsme zmínili dříve, musí být zadány správné hodnoty a rozměry. Rozměry opět hledejte v souhrnném přehledu vlastností kolony, abyste měli jistotu jejich správnosti. Délku můžete odhadnout spočítáním smyček kolony na držáku a vynásobením délkou 0.54m u standardních kolon nebo násobením délkou 0.4m u kolon s 5 palcovými držáky. Pro další detaily kontaktuje technickou podporu Agilent, nebo servisní oddělení vašeho distributora.

HPST: Chromatogram slepého - blank nástřiku v čase

Vždy je dobré vědět, jak vypadá váš systém bez přítomnosti vzorku, nebo během slepého nástřiku. Tato informace se vám bude hodit později v momentě, kdy budete hledat příčinu jakýchkoliv obtíží či nesrovnalostí v odezvě systému, pokud nastanou. Po kondicionaci kolony tedy neváhejte a proveďte slepý nástřik. Můžete využít váš standardní teplotní program, nebo třeba následující. Začněte na 40 až 50 °C s gradientem 10 až 20 °C/min až na jakoukoliv nejvyšší limitní teplotu platnou pro vaši metodu, například 300 °C, a tuto teplotu držte po 10 až 15 minut. Chromatogram pozadí si následně uložte pro budoucí porovnání. Jak jsme zmínili dříve, může se vám hodit při hledání příčin nežádoucí odezvy. Na chromatogramu slepého nástřiku by neměly být žádné píky. Případné píky během slepého nástřiku poukazují na problém kontaminace cesty vzorku před kolonou, obvykle tedy v prostoru inletu, nebo dokonce ještě před ním. Jak se kolona s používáním opotřebovává, zvyšuje se míra vzestupu základní linie. Pokud se nárůst základní linie objevuje už při mnohem nižších teplotách, než jste pozorovali při poslední kontrole, velmi pravděpodobně došlo buď ke kontaminaci kolony, nebo dokonce k jejímu poškození, případně ke kontaminaci GC systému.

Pro další informace se obracejte na produktového specialistu Daniela Sandera ([email protected]).