Robustnost analytické metody a Hodnocení linearity | LabRulez GCMS

Robustnost analytické metody a Hodnocení linearity

Čt, 18.11.2021
| Originální článek z: Česká chromatografická škola/Michal Douša
Tento díl seriálu HPLC.cz o Validacích analytických metod blíže rozebere robustnost analytického postupu a design jeho experimentů a podívá se také na problematiku hodnocení linearity.
HPLC.cz: Robustnost analytické metody a Hodnocení linearity

HPLC.cz: Robustnost analytické metody a Hodnocení linearity

Definice

Anglický ekvivalent pro robustnost je Ruggedness nebo Robustness. První zmínka o robustnosti – Youden (1961): "… analytical process need to be „rugged“…

Robustnost analytického postupu je mírou jeho kapacity zůstat netečný vůči malým, ale záměrným změnám parametrů metody a poskytuje informaci o jeho spolehlivosti během běžného používání.

Robustnost je tudíž schopnost metody být „netečná k mírným (a nevyhnutelným) odchylkám od některé obvyklé rutinní činnosti“ (W.J. Youden, Statistical techniques for collaborative tests. Statistical manual of the AOAC, Washington DC.

Dále může být robustnost definována jako míra vlivu mírného kolísání úrovně jednotlivých parametrů na výsledek analytického stanovení. Definice robustnosti je v každém protokolu jiná (ICH, FDA, PhEur, JP, USP).

Srozumitelná definice je následující: Robustnost metody je definována jako míra kapacity metody při jejím reprodukování za nepatrně změněných podmínek. Změna podmínek může nastat pro případ mezilaboratorních zkoušek (jiná laboratoř, analytik, instrument = RUGGEDNESS) nebo změnou podmínek v jedné laboratoři (teplota, koncentrace, doba extrakce = ROBUSTNESS).

Zde si dovolím nadefinovat svou vlastní verzi

Robustnost metody je taková vlastnost metody, kdy malou změnou jejich parametrů, poskytuje metoda pořád správné a přesné výsledky.

Největší problém při ověřování robustnosti podle výše uvedených definic je definování míry (velikosti) odchylky (parametru) resp. mírného kolísání úrovně. Nebyla stanovena žádná kriteria (velikost odchylky), ale obecně by se mělo vycházet z nejistoty měření nebo předpisů (PhEur, JP, USP).

Co je cílem resp. výsledkem ověření robustnosti metody?

Výsledkem není závěr, že metoda je robustní nebo nerobustní, ale výsledkem robustnosti je informace, jaké parametry metody jsou kritické vyžadující pečlivou kontrolu. Výsledkem robustnosti může být také interval kritických parametrů metody, ve kterém metoda poskytuje nejmenší chyby měření.

Experimental design

Při ověřování robustnosti existují dva zásadní přístupy k tomuto problému: univariační (jednorozměrná) analýza dat nebo tzv. multivariační (vícerozměrná) analýza dat.

Univariační (jednorozměrná) analýza dat

Postup: Mění se jeden parametr (faktor) v čase a ostatní parametry (faktory) zůstávají fixní a sleduje se jak ovlivní výsledek. Poté se experiment zopakuje s dalším parametrem – tzv. přístup OFAT (One Factor At Time).

Příklad: Nechť máme 3 parametry (A,B,C) a sledujeme pouze dva extrémy každého parametru: (-) a (+) a ostatní zůstávají neměnné (0) atd …, pak metodou OFAT dostaneme následující kombinace:

HPLC.cz: Přístup OFAT (One Factor At Time)

Pro počet experimentů obecně platí: 2*k+1. Mluvíme o tzv. hvězdicovém schématu („

HPLC.cz: Hvězdicové schéma

Další z používaných algoritmů je tzv. zrcadlové faktorové schéma („

HPLC.cz: Zrcadlové faktorové schéma

Pro počet experimentů obecně platí: 2*(2k+1) a dostáváme následující kombinace:

HPLC.cz: Přístup OFAT (One Factor At Time)

Multivariační (vícerozměrná) analýza dat

Robustnost metody vůči malým změnám se testuje na základě plánovaných pokusů (úplných nebo zkrácených).

Příklad: Pro jednoduchost = výsledek ovlivní pouze dvě proměnné veličiny (např. teplota a čas; veličiny mohou být plynule měnitelné nebo i binární). Při experimentu převádíme všechny proměnné na binární: + a – (u plynule proměnných tedy volíme dva stavy: nominální a extrémní a počet úrovní proměnné veličiny je tedy 2). Plán pak lze popsat takto:

HPLC.cz: Plán testování

Velice časově náročné, v případě že chceme sledovat vliv 4 proměnných pak dostaneme 2⁴ = 16 experimentů, které je nutné udělat. Obecně platí: 2ᵏ. Nárůst poštu experimentů je patrný z tabulky:

HPLC.cz: Nárůst poštu experimentů

Při optimalizaci postupu pro silanizaci silikagelu pro HPLC museli autoři posoudit 23 proměnných. V případě, že by jeden experiment trval 10 minut, pak k provedení úplného plánu bylo zapotřebí 160 let nepřetržité práce.

Z důvodu takto velkých počtů experimentů se zanedbává možnost ovlivňování jednotlivých proměnných => tzv. neúplné faktorové plány (fiktivní proměnné) s různými algoritmy. Postup pro testování pomocí Plackett-Burmanova plánu je popsán zde.

Existuje ještě řada dalších postupů a algoritmů hodnocení, pro úplnost uvádím Dongův, Vander Heydenův, Youdenův algoritmus.

Hodnocení linearity

Linearita je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tj. odezvou instrumentace (analytickým signálem) a koncentrací analytu. V současné době se k hodnocení linearity používá téměř výhradně korelační koeficient. Korelační koeficient R měří stupeň korelace a ne linearitu. Závisí na rozložení bodů na přímce! Proto se mohou používat další testy, které daleko více vypovídají o linearitě:

QC koeficient

Pro QC koeficient platí:

HPLC.cz: QC koeficient

kde ȳ jsou predikované (odhadnuté, vyrovnané) hodnoty yᵢ, tj. hodnoty vypočtené z regresní rovnice.

QC koeficient se používá v kombinaci s korelačním koeficientem a linearita se obecně považuje za prokázanou, když R > 0.99 a QC < 5%. (14)

Analýza rozptylu (ANOVA) na těsnost proložení

Používá se tam, kde je k dispozici řada minimálně 6 standardů se 2-3 opakovanými měřeními pro každou koncentrační úroveň. Pro F platí:

HPLC.cz: Analýza rozptylu (ANOVA) na těsnost proložení

kde k je počet koncentračních úrovní a n je celkový počet měření, SSPE je suma čtverců reziduí zapříčiněná nepřesným měřením a SSLOF je suma čtverců reziduí zapříčiněná nedostatečným proložením dat. Linearita se obecně považuje za prokázanou, když F < Ft(P=0,95; f=k-2; n-k).

T-test na významnost kvadratického členu

U modelu regresní přímky lze ověřit předpoklad linearity testováním významnosti kvadratického členu pro rovnici y = a + bx+c²x. Testovací kritérium má tvar:

HPLC.cz: T-test na významnost kvadratického členu

kde RSCk jako reziduální součet čtverců pro kvadratický model a RSCL jako reziduální součet čtverců pro lineární model. Linearita se obecně považuje za prokázanou, když FL < Ft(P=0,95; f=1; n-3).

Přehled metodiky pro transfer analytických metod publikoval P. Araujo. (15)

Zdroje

Literatura

  1. Jones K., J. Chromatogr. 392 (1987) 1.
  2. Plackett R.L., Burmann J.P., Biometrika 33 (1946) 305.
  3. M. Mulholland, TRAC, 7 (1988) 383.
  4. Y. Vander Heyden, F. Questier and D.L. Massart, J. Pharm. Biomed. Anal. 8 (1998) 43.
  5. van de Vaart F.J. et al., Het Pharmaceutisch Weekblad 127 (1992) 1229.
  6. M. Mulholland, J. Waterhouse, J. Chromatogr. 395 (1987) 539.
  7. Y. Vander Heyden, C. Hartmann, D.L. Massart; L. Michel, P. Kiechle, F. Erni, Anal. Chim. Acta 316 (1995) 15.
  8. Y. Vander Heyden, F. Questier, D.L. Massart, J. Pharm. Biomed. Anal. 17 (1998) 153.
  9. Y. Vander Heyden, D.L. Massart; Y. Zhu, J. Hoogmartens, J. De Beer; J. Pharm. Biomed. Anal. 14 (1996) 1313.
  10. Y. Vander Heyden, C. Hartmann, D.L. Massart, P. Nuyten, A.M. Hollands, P. Schoenmakers, J. Chromatogr. A 756 (1996) 89.
  11. Y. Vander Heyden, M. Jimidar, E. Hund, N. Niemeijer, R. Peeters, J. Smeyers-Verbeke, D.L. Massart, J. Hoogmartens, J. Chromatogr. A, 845 (1999) 145.
  12. ICH Harmonised Tripartite Guideline prepared within the Third International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), Validation of Analytical Procedures : Methodology, 1996, 1-8.
  13. Youden W.J., Mater. Res. Stand. 1 (1961) 863.
  14. J. Van Loco, M. Elskens, Ch. Croux, H. Beernaert: Accredit. Qual. Assur. 7 (2002) 281-285.
  15. P. Araujo: J. Chrom. B. 877, 2224 (2009).
Česká chromatografická škola
 

Mohlo by Vás zajímat

Accurate Mass Library for Natural Products Based on Compounds Identified in Hemp Oil Using High-Resolution GC/Q-TOF

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/HRMS, GC/Q-TOF
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) in Palm Oil by GC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Determination of Polycyclic aromatic hydrocarbons in soils using the EXTREVA ASE Accelerated Solvent Extractor and GC-MS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Příprava vzorků, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí

Comprehensive Evaluation of Scotch Whisky Aroma Profiles Using SPME-GCxGC-TOFMS

Aplikace
| 2022 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, SPME, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Potraviny a zemědělství

NEMC: Increasing Sample Throughput in Ultra-trade Environmental Analysis with the TSQ-9610 GC- MS/MS

Prezentace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Validační program pro statistické zpracování analytických dat

Validační program slouží ke statistickému prokázání spolehli­vosti analytické metody včetně celého obslužného analytického systému, kdy proces získávání a zpracování dat má významný vliv na výsledek.
 

Mohlo by Vás zajímat

Accurate Mass Library for Natural Products Based on Compounds Identified in Hemp Oil Using High-Resolution GC/Q-TOF

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/HRMS, GC/Q-TOF
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) in Palm Oil by GC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Determination of Polycyclic aromatic hydrocarbons in soils using the EXTREVA ASE Accelerated Solvent Extractor and GC-MS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Příprava vzorků, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí

Comprehensive Evaluation of Scotch Whisky Aroma Profiles Using SPME-GCxGC-TOFMS

Aplikace
| 2022 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, SPME, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Potraviny a zemědělství

NEMC: Increasing Sample Throughput in Ultra-trade Environmental Analysis with the TSQ-9610 GC- MS/MS

Prezentace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Validační program pro statistické zpracování analytických dat

Validační program slouží ke statistickému prokázání spolehli­vosti analytické metody včetně celého obslužného analytického systému, kdy proces získávání a zpracování dat má významný vliv na výsledek.
 

Mohlo by Vás zajímat

Accurate Mass Library for Natural Products Based on Compounds Identified in Hemp Oil Using High-Resolution GC/Q-TOF

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/HRMS, GC/Q-TOF
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) in Palm Oil by GC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Determination of Polycyclic aromatic hydrocarbons in soils using the EXTREVA ASE Accelerated Solvent Extractor and GC-MS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Příprava vzorků, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí

Comprehensive Evaluation of Scotch Whisky Aroma Profiles Using SPME-GCxGC-TOFMS

Aplikace
| 2022 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, SPME, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Potraviny a zemědělství

NEMC: Increasing Sample Throughput in Ultra-trade Environmental Analysis with the TSQ-9610 GC- MS/MS

Prezentace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Validační program pro statistické zpracování analytických dat

Validační program slouží ke statistickému prokázání spolehli­vosti analytické metody včetně celého obslužného analytického systému, kdy proces získávání a zpracování dat má významný vliv na výsledek.
 

Mohlo by Vás zajímat

Accurate Mass Library for Natural Products Based on Compounds Identified in Hemp Oil Using High-Resolution GC/Q-TOF

Aplikace
| 2022 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/HRMS, GC/Q-TOF
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) in Palm Oil by GC-MS/MS

Aplikace
| 2022 | Shimadzu
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Shimadzu
Zaměření
Potraviny a zemědělství

Determination of Polycyclic aromatic hydrocarbons in soils using the EXTREVA ASE Accelerated Solvent Extractor and GC-MS

Aplikace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Příprava vzorků, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí

Comprehensive Evaluation of Scotch Whisky Aroma Profiles Using SPME-GCxGC-TOFMS

Aplikace
| 2022 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, SPME, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Potraviny a zemědělství

NEMC: Increasing Sample Throughput in Ultra-trade Environmental Analysis with the TSQ-9610 GC- MS/MS

Prezentace
| 2022 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, GC/QQQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Článek | Akademie

Validační program pro statistické zpracování analytických dat

Validační program slouží ke statistickému prokázání spolehli­vosti analytické metody včetně celého obslužného analytického systému, kdy proces získávání a zpracování dat má významný vliv na výsledek.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.