Úvod do GC×GC a větší možnosti komprehenzivní chromatografie

Záznam prednášky 👉 link to Vimeo video

• Introduction to GC×GC and the Bigger Picture of Comprehensive Chromatography (Katelynn Perrault, Chaminade University Honolulu), GCxGC Symposium & Workshop 2020

Komprehenzivní dvourozměrná plynová chromatografie (GCxGC) je technika, která existuje již více než 25 let. Někdo může namítnout, že tato technika byla přehnaně medializována a že jde o komplikovaný výzkumný nástroj, který se nehodí do rutinních analytických laboratoří. Několik rutinně ověřených GCxGC metod však prokázalo, že tato technika je správná, přesná a robustní.

Výzkum ukázal výhody GCxGC v široké škále aplikací (např. životní prostředí, metabolomika, petrochemie, bezpečnost potravin, analýza vůní). Mezi výhody patří:

• zvýšená separační kapacita/kapacita píků (tj. rozlišení)
• strukturované dvourozměrné chromatogramy (tj. obrysové grafy)
• zvýšení citlivosti

Přednosti GCxGC jako separační vědy jsou jasné, ale jak jsou prospěšné pro rutinní laboratoře?

• Více tříd analytů lze zkombinovat do jediné analýzy, aby se ušetřil přístrojový čas a čas na přípravu vzorku.

• Čas manuální kontroly u necílových screeningových metod lze zkrátit zvýšeným rozlišením píku GCxGC analýzy dosažením lepší shody s knihovnou, což povede k rychlejší a jistější identifikaci píku.

• Charakterizace vzorků je GCxGC analýzou lepší, což zvyšuje důvěru v provedená rozhodnutí založená na analytických výsledcích.

• Extra rozlišení, které poskytuje GCxGC analýza umožňuje také použití ekonomičtějších detektorů, jako je plamenově ionizační detektor (FID) nebo detektor elektronového záchytu (ECD).

Úvod

Jednorozměrné analýzy (1D-GC) komplexních environmentálních, biologických nebo petrochemických vzorků plynovou chromatografií často vedou k získání chromatogramu s velkým podílem nerozlišených složek. K vyřešení některých složitostí lze použít hmotnostní spektrometrii (MS), ale strukturní izomery a velké koncentrační rozdíly mohou analýzu dat a spektrální interpretaci zkomplikovat. Chromatografické rozlišení lze částečně zlepšit účinnější delší, užší kapilární kolonou s tenkou vrstvou stacionární fáze, ale delší doba analýzy a snížená kapacita vzorku mohou být pro vytížené laboratoře se složitými vzorky neatraktivní.

Vícerozměrná plynová chromatografie (MDGC nebo 2D-GC) zvyšuje rozlišení separace použitím dvou samostatných kolon se dvěma různými stacionárními fázemi. Jedna z forem MDGC je heart-cutting. Po počáteční separaci vzorku může být nerozdělená část GC efluentu z první kolony před vstupem do detektoru převedena do jiné/druhé separační kolony. Heart-cutting může být jednoduchým způsobem, jak dosáhnout lepší separace komplexní směsi, i když v tomto případě může být vylepšena pomocí kolony druhé dimenze pouze část jednorozměrné separace.

Komprehenzivní dvourozměrná plynová chromatografie (GCxGC) využívá vysokofrekvenční modulátor k přesměrování celého toku z první kolony na kolonu druhé dimenze. Předchozí znalost separace (nebo její absence) není k optimalizaci analýzy nutná, protože každý pík je přenesen do kolony druhé dimenze. Detektor zaznamenává retenční časy první i druhé dimenze a odezva se vykresluje ve dvourozměrném chromatografickém záznamu/rovině (tj. obrysový graf) (obrázek 1).

LECO: Obrázek 1: Znázornění a ukázka GCxGC separace

Chromatografický separační prostor je ve srovnání s konvenční 1D-GC analýzou dramaticky větší, což přináší velký skok v potenciální maximální kapacitě separace. Kromě lepšího rozlišení je výsledný chromatogram také strukturován tak, že podobné sloučeniny eluují v seskupených pásech napříč rovinou chromatogramu. Shlukování chemicky a strukturně podobných sloučenin poskytuje užitečné vodítko, které může pomoci při identifikaci píku. Dalším pozitivním vedlejším účinkem GCxGC analýzy je lepší detekovatelnost sloučeniny. Když modulátor rychle zachytí a „nastříkne“ efluent z primární kolony, zaostří píky pouze několik sekund před detekcí. Tento proces zlepšuje poměr signálu k šumu (S/N).

Inovativní skoky a široké přijetí v technologiích, jako je GCxGC, může chvíli trvat. Například přechod rutinních metod z náplňových GC na kapilární GC trval desítky let (můžete klidně tvrdit, že v určitých oblastech transformace stále probíhá!). Lepší rozlišení kapilární GC analýzy bylo poprvé prokázáno v roce 1957 separací m- a p-xylenu (1). Analytici v oblasti petrochemických analýz byli prvními uživateli kapilární GC a těžili tak ze zvýšené maximální kapacity (tj. rozlišení) u komplexních vzorků. Ačkoli tato technika byla lepší než kolony náplňové, rozšířené přijetí bylo pomalé kvůli použití a robustnosti kapilárních kolon (skla). Problém robustnosti byl nakonec vyřešen v roce 1979 zavedením kapilárních kolon z taveného oxidu křemičitého (2), ale stále trvalo desetiletí, než se rutinní akreditované metody převedly z technologie plněných na kapilární kolony. Výhody kapilárních kolon jsou nepopiratelné a posunuly naše znalosti o chemickém složení bezpočtu vzorků.

Podobně jako u přechodu z náplňových kolon na kapilární kolony byl přenos 1D-GC na GCxGC v regulovaných odvětvích pomalý. Tato technika byla poprvé demonstrována v roce 1991 (3). První uživatelé zjistili, že zvýšená separační kapacita byla užitečná pro složité environmentální a petrochemické vzorky. Komercializace GCxGC instrumentace vybavené termálním modulátorem v roce 2002 (4) podnítila výzkum v širokém spektru aplikačních oblastí (např. petrochemie, metabolomika, životní prostředí, bezpečnost potravin, vůně).

Podobné překážky z pohledu jednoduchosti použití a robustnosti omezily přijetí také GCxGC platformy. Vývoj a optimalizace metod byly vyjádřeny jako obtížné a únavné a pouze pro zkušeného analytika. V posledních letech byly ale tyto překážky minimalizovány, což usnadňuje implementaci této techniky do rutinních laboratoří. Byly vyvinuty užitečné příručky (5) a nástroje (6), které uživatelům při vývoji GCxGC metody pomáhají. Modulátory toku byly komercializovány také pro uživatele, kteří mají zájem vyzkoušet GCxGC s nižší počáteční cenou. Robustnost metody byla prokázána několika publikovanými validovanými metodami (7-11). GCxGC je v současné době v procesu přechodu od akademického použití ke každodenní běžné analýze. V rutinní laboratoři může komprehenzivní dvourozměrná analýza plynovou chromatografií ušetřit čas kombinací několika tříd sloučenin do jedné analýzy a zároveň zkrátit přípravu vzorku a čištění pomocí chromatografického rozlišení matricových interferencí. Když je potřeba kompletní charakterizace vzorku, GCxGC analýza urychlí screening a poskytne náhled na vzorek, kterému se žádná jiná chromatografická technika nevyrovná. Pro rutinní analýzy lze použít místo spoléhání se na hmotnostní spektrometry k rozlišení složitých směsí také ekonomičtější detektory typu FID nebo ECD.

Šetřete čas pomocí analýz více druhů analytů (Multi-Class)

V rutinních laboratořích čas = peníze. Laboratoře, které mají za úkol monitorovat látky znečišťující životní prostředí, se například potýkají se snižováním provozních rozpočtů, špinavými vzorky (např. půdy, sedimenty, kaly) a rostoucím koktejlem chemických kontaminantů. Kontaminované vzorky často obsahují více tříd analytů. Kontaminanty, jako jsou polychlorované bifenyly (PCB) a bromované zpomalovače hoření (BFR), jsou halogenované sloučeniny, které se běžně analyzují pomocí ECD detektoru. ECD je nespecifický detektor; proto musí být extrakty vzorků pečlivě frakcionovány, aby se předešlo interferencím. Kroky frakcionace lze při implementaci GCxGC metody omezit nebo zcela eliminovat. Využitím separačních možností druhé dimenze lze analyzovat více tříd komponent v jediné analýze (obrázek 2).

LECO: Obrázek 2: Halogenované kontaminanty lze analyzovat v jednom nástřiku pomocí GCxGC-μECD. Bromované zpomalovače hoření (BFR) a polychlorované bifenyly (PCB) se často nacházejí ve stejném extraktu vzorku. GCxGC snižuje potřebu frakcionačních kroků.

Snižte spotřebu rozpouštědel díky zjednodušené přípravě vzorků

Doba přípravy vzorku může být pro analýzu reziduí pesticidů v zemědělských a potravinářských vzorcích dlouhá. Metoda přípravy vzorků QuEChERS (rychlá, snadná, levná, efektivní, robustní a bezpečná) je obecná metoda extrakce a čištění mnoha reziduí, která ušetřila čas potřebný na přípravu jednoho vzorku především v rutinních laboratořích bezpečnosti potravin. Široký extrakční přístup je výhodný pro současnou multitřídovou analýzu reziduí; složky koextrakční matrice jsou však v extraktu také přítomny a mohou interferovat s cílovými analyty. Separační možnosti druhé dimenze v GCxGC analýze tak lze použít k chromatografickému odstranění interferencí u sledovaných pesticidů a k zjednodušení tradičních, komplexních postupů přípravy vzorků (obrázek 3).

LECO: Obrázek 3: GCxGC-TOFMS byl použit k analýze QuEChERS extraktu z tabáku. V 1D-GC analýze by interference matrice zakryla detekci široce používané pesticidní složky, piperonylbutoxidu. Automatizované hledání píku v softwaru LECO ChromaTOF identifikovalo piperonylbutoxid s podobností knihovny 876.

Snižte manuální práci s automatickou identifikací píků

S rostoucím počtem potenciálních chemických kontaminantů (v životním prostředí, potravinách, lidském organizmu, zvířatech atd.) se zvyšuje potřeba rutinních necílových screeningových metod. Jednou z výhod použití GCxGC je strukturovaná eluce složek ve dvourozměrném obrysovém grafu. S nespecifickým detektorem, jako je FID nebo ECD, lze obrysový graf použít k seskupení sloučenin na základě jejich chemické třídy. Při použití hmotnostního spektrometru (MS) jako detektoru lze pak neznámé píky dále identifikovat prohledáváním knihovny hmotnostních spekter (např. NIST). Porovnávání s knihovnou může být v 1D-GC analýze komplikovanější z důvodu možných koelucí, které hmotnostní spektrum zkreslují a výsledkem pak jsou nekvalitní výsledky vyhledávání. Kvalita vyhledávání závisí na podobnosti vybraného spektra s referenčním hmotnostním spektrem. GCxGC-TOFMS může pomoci při identifikaci neznámého píku několika způsoby.

• Za prvé, velká separační síla v GCxGC znamená více oddělených píků. Pokud je pík lépe rozlišen od okolních interferencí, je pravděpodobnější, že bude mít vysokou shodu s knihovnou (za předpokladu, že daný analyt v knihovně je).

• Za druhé, může TOFMS provádět spektrální dekonvoluci, která matematicky odděluje spektrální překrytí pro společně eluované analyty. To také působí tak, že „čistí“ hmotnostní spektrum pro získání lepší shody s knihovnou (obrázek 4).

• A konečně, kvůli těmto faktorům může integrovaný software automatizovat výběr, vyhledávání a identifikaci neznámých píků a vytvářet tabulku píků.

I když je k ověření výsledků automatického hledání píku stále nutná ruční kontrola, celkový čas na vytvoření seznamu identifikovaných píků se výrazně zkrátí.

LECO: Obrázek 4: Souběžné srovnání analýzy GC-TOFMS a GCxGC-TOFMS stejného vzorku krmiva pro domácí zvířata.

A) V hmotnostním spektru GC-TOFMS látka používána pro dochucení 2-propionylthiazol měla shodu s knihovnou 660. Spektrální dekonvoluce nebyla v hmotnostním spektru schopna rozdělit (nebo identifikovat) koeluující sloučeninu s m/z 136.

B) V obrysovém grafu GCxGC-TOFMS byly dvě společně eluované sloučeniny chromatograficky rozděleny ve druhé dimenzi. Shoda s knihovnou se pro 2-propionylthiazol zlepšila na 891 a pík s m/z 136 byl identifikován jako 2-acetyl-3-methylpyrazin se shodu s knihovnou 860 (nezobrazeno).

Urychlete výzkum pomocí zvýšené kapacity píků

Jedním z nejlepších (a nejvíce medializovaných) použití GCxGC je separace a identifikace všech jednotlivých komponent, které vzorek tvoří. Charakterizace vzorku může být zásadní pro forenzní praxi, identifikaci drog nebo včasnou diagnostiku onemocnění. Když se vyvine GCxGC metoda s maximálním chromatografickým rozlišením (tj. True Peak Capacity Increase) (5, 15) lze získat otisk prstu daného vzorku, který je pak užitečný pro další rozdělování zdrojů např. v environmentální forenzní analýze. Indikátorové molekuly (tj. biomarkery) jsou často v GC chromatogramu malé píky, které můžou být snadno v 1D-GC analýze překryty (obrázek 5).

LECO: Obrázek 5: Konturový graf GCxGC-TOFMS analýzy vzorku dehtové kuličky a předpokládaného zdroje ropy. Extrahované iontové chromatogramy (XIC) jsou zvětšeny, aby se ukázala podobnost mezi těmito dvěma vzorky. Hopany jsou molekulární fosilie, které jsou odolné a jsou důležitými biomarkery, které pomáhají při identifikaci a děloní zdrojů. Při 1D-GC analýze je obtížnější identifikovat hopany kvůli interferencím s později eluovanými uhlovodíky.