Karel Ubik: Historie hmotnostní spektrometrie v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR

Karel Ubik pochází z Moravy a Vysokou školu chemicko-technologickou absolvoval v Pardubicích v roce 1962. Jeho vědecká kariéra je úzce spjata s Ústavem organické chemie a biochemie AV ČR Praha, kde v roce 1965 nejprve nastoupil na studijní pobyt v laboratoři analytické chemie a kandidátskou disertační práci obhájil v roce 1969. S hmotnostní spektrometrií začal v roce 1971 po přechodu do laboratoře HS, kterou později přes 20 let vedl. Věnoval se především aplikacím hmotové spektrometrie pro řešení struktur přírodních látek jako např. terpenoidů, steroidů, saponinů, flavonoidů, alkaloidů, mastných kysekin, polypeptidů aj. Absolvoval řadu zahraničních cest a stáží, jako např. v USA, Mexiku, Velké Británii, Švédsku, Bulharsku aj., kde spolupracoval s předními organickými chemiky. V rámci pedagogické činnosti přednášel na českých a zahraničních univerzitách a sympoziích, na postgraduákních kurzech a pravidelně (až do roku 2010) na školách hmotnostní spektrometrie v rámci Spektroskopické společnosti J.M. Marci. Je autorem přes 120 odborných prací a napsal několik přehledných skript, ve kterých kladl důraz na interpretaci spekter. Od roku 2006 je v důchodu.

Historie hmotnostní spektrometrie v ÚOCHB AV ČR (tehdy ČSAV, tj. Československé akademii věd) a potažmo v Československé republice začala začátkem 60-let 20. století kdy zásluhou prof. Františka Šorma, v té době ředitele ústavu a generálního sekretář akademie, byly ze Sovětského svazu zakoupeny dva hmotnostní spektrometry MCh-1303. Oba spektrometry byly tehdy umístěny v Ústavu fyzikální chemie ČSAV v Máchově ulici v Praze. Na jednom přístroji měřil Vladimír Hanuš a na druhém, určeném pro potřeby ÚOCHB, měřil Ladislav Dolejš, který absolvoval půlroční stáž v USA u jednoho ze nejvěhlasnějších hmotnostních spektrometristů té doby prof. Carla Djerassiho.

Spektrometry MCh-1303 měly elektronovou ionizaci, hmotnostní rozsah 600 Da a rozlišovací schopnost 450. Byly vybaveny rtuťovými difusními vývěvami, které byly chlazené kapalným dusíkem a přes noc se vypínaly, takže evakuace začínala každé ráno. Spektra, jejichž píky měly typický Gaussovský tvar, se zaznamenávala na papír chromatografickým zapisovačem velmi špatné kvality a proto byl vyměněn za zapisovač Honey-Well. Poměrně značnou nevýhodou byla relativně dlouhá katoda (asi 15 mm), která když se zahřátím prodloužila se někdy prohnula, emitované elektrony nesměřovaly přímo do dráhy ionizovaných molekul a citlivost klesla na tolik, že musel být drátek emitoru vyměněn. Vzorky se zaváděly skleněnou sondou s kovovou přírubou, kterou bylo při každé výměně vzorku nutno 4 šrouby odšroubovat, vložit vždy nové hliníkové těsnění a zase přišroubovat. Efektivita práce byla nízká, protože bylo možno za den změřit spektra dvou až tří látek.

Přes řadu technických nedostatků byla na spektrometru MCh-1303 změřena celá řada látek. Z přírodních látek to byla zejména identifikace alkaloidů, o nichž byly publikovány kvalitní a dosud citované práce. Vůbec první hmotově spektrometrická práce autorů z Československé republiky byla publikována již v roce 1963 o steroidních alkaloidech – L. Dolejš, V. Hanuš, V. Černý, F. Šorm: On Steroids LXXVIII. Mass Spectra of Holarrhena Alkaloids, Coll. Czech.Chem.Commun. 28, 1584-1592 (1963).

Později, když se ukázal velký význam hmotnostní spektrometrie pro problematiku řešenou v ústavu, byl spektrometr MCh-1303 v roce 1967 přestěhován přímo do ústavu na Flemingově náměstí v Praze 6 a stal se tak základem hmotově-spektrometrické laboratoře, kterou vedl Ladislav Dolejš. Na přístroji se měřilo až do roku 1972 kdy byl demontován na větší celky a věnován Přírodovědecké fakultě KU v Praze, kde ale nebyl nikdy znovu sestaven.

Kvalitativním skokem bylo v roce 1969 zakoupení anglického spektrometru MS902 (původně AEI - Associated Electric Industry, později KRATOS a nakonec Shimadzu, Manchester, UK), který byl ve své době nejlepším komerčně vyráběným spektrometrem na světě. Spektrometr měl dvojí fokusaci s tzv. přímou geometrii, tj. uspořádání analyzátorů EB a kromě přímých vstupů také umožňoval analýzy GC/MS. Používala se jenom elektronová ionizace s elektronovou energií 70 eV, kterou bylo možno snižovat, a při základním urychlovacím napětí 8 kV byl rozsah přístroje 1000 Da. Maximální rozlišovací schopnost byla 70000 a pro většinu měření při vysoké rozlišovací schopnosti, kdy postačovalo rozlišení 10000, byla přesnost měření do 3 ppm. Spektrometr měl vynikající optiku, takže při přechodu z rozlišení 1000 na 10000 se snížila intenzita píků jenom 7x. Měření přesných hmotností se provádělo ručně srovnáváním hmotností píků (ang. Peak matching), kdy se pík standardu se známou přesnou hmotností překrýval na obrazovce osciloskopu píkem měřené látky tím, že se pomocí dekády snižovalo urychlovací napětí jednoho z píků.

Vakuum bylo zajištěno dvěma rotačními a dvěma difusními pumpami s parafinovým olejem chlazeným kapalným dusíkem. I když se mohla spektra měřit při různém tlaku přepínáním řádů vakua od 10⁻⁴ do 10⁻⁷ tak se výhradně měřilo při 10⁻⁷ torr, tj v rozsahu jednoho řádu. Hlavním důvodem tohoto opatření byla skutečnost, že docházelo k minimální kontaminaci iontového zdroje, který tak stále udržoval vysoké parametry, zejména pak rozlišení.

Spektra se zapisovala na UV zapisovači a měla kromě stopy pro škálu hmotností ještě další 3 stopy. Základní, pro citlivost zvýšenou 10x a pro citlivost zvýšenou 100x. Škála hmotností byla nepřesná, protože byla vytvářena snímáním magnetického pole jenom smyčkou (pozn. Hallovy sondy se ještě nepoužívaly) a proto musela být obvykle čárkována ručně. Spektrum se snímalo od vyšších hmotností k nižším a vzhledem k tomu, že má magnetické pole exponenciální průběh, tak vzdálenosti mezi jednotlivými píky byly oblasti velkých hmotností velmi malé a při snímání spektra se postupně zvětšovaly až několikanásobně. Aby se délka zapsaného spektra zbytečně neprodlužovala, tak byla rychlost záznamového UV-citlivého papíru během záznamu několikrát přepnutím snižována. Přístroj měl i možnost použít lineární škálu hmotností, ale ta byla také nepřesná.

Pro normalizaci spekter bylo nutno intenzitu píků měřit ručně měřítkem a sestavit tabulku m/z / mm. Tato tabulka byla ručně převedena do prvního a jediného ústavního počítače Hewlett-Packard, ke kterému byl připojen inkoustový plotter.

Pro zavádění vzorků do iontového zdroje sloužily 4 vstupy. Přímý vstup pro málo těkavé, většinou pevné, látky (přibližně od 250 Da), nevyhřívaný skleněný zásobník (objem cca 1 l), vyhřívaný skleněný zásobník (objem cca 2 l) a vstup pro látky z plynového chromatografu. Na přímém vstupu pro málo těkavé látky bylo vynikající to, že se vzorek v křemenné kapiláře na kovové tyčce zasouval pomocí magnetu přímo do bloku iontového zdroje. To mělo nesmírnou výhodu pro kvalitu spektra v tom, že se teplota vzorku zvyšovala současně se zvyšováním teploty iontového zdroje a byla proto pro změření spekter vždy naprosto optimální. Nedocházelo ke zkreslování spekter vlivem přehřátého iontového zdroje, jak se to stává u většiny dnešních spektrometrů pro EI.

Skleněné zásobníky byly od iontového zdroje odděleny hustými kovovými fritami, které udržovaly rozdílné hodnoty vakua v zásobnících (rotačkové vakuum) a v iontovém zdroji (difusní vakuum). Nevyhřívaný zásobník se používal pro standardy na kalibraci a měření při vysoké rozlišovací schopnosti.

Vynikající vlastnosti, které nemá žádný ze současně používaných tzv. septum inletů, měl sofistikovaný vyhřívaný zásobník, jenž byl opatřen čtyřmi skleněnými ventily s kovovými jádry ovládanými magnety. Tento systém umožňoval měřit vzorek za tepelně optimálních podmínek a ještě po měření získat vzorek ze zásobníku zpět na další použití, např. změření IČ spektra. Pro analýzu nesmírně malých množství přírodních látek, např. těkavých látek z hmyzu, to bylo velmi užitečné. Při zavádění vzorku do iontového zdroje se vzorek vložil do speciální upravené minizkumavky, která se ochladila kapalným dusíkem a rotačním vakuem se přisála k zásobníku. Otevřel se vstup do iontového zdroje ze zásobníku a odstranilo se chlazení. Teplota vzorku nejprve stoupla na úroveň laboratorní teploty, a pokud nezačal vzorek vstupovat do zásobníku a tím do iontového zdroje, tak se začala zkumavka spolu se zásobníkem zahřívat až na optimální teplotu kdy se na obrazovce osciloskopu objevilo spektrum. Vzorek i zásobník se zahřívaly maximálně na 250 °C. Pokud ani při této teplotě nebylo získáno spektrum, tak byl vzorek po ochlazení na laboratorní teplotu zaveden do spektrometru přímým vstupem pro méně těkavé látky. Po změření spektra byl vzorek ze zásobníku odstraněn vyčerpáním rotační vývěvou a nebo, při potřebě ho získat zpět, byla dávkovací zkumavka ochlazena kapalným dusíkem. Vzorek potom nadestiloval zpět do minizkumavky a mohl být dále použit.

Pro techniku GS/MS, v té době s pouze náplňovými kolonami, byl spektrometr MS902 on-line spojen s plynovým chromatografem PYE 104 prostřednictvím Watson-Biemannova efusního separátoru. Separátor odstranil většinu nosného plynu (He, průtok cca 15 ml/sec), zvýšil koncentraci vzorků v plynovém toku a zabránil výpadku přístroje, který by způsobilo neúměrné zvýšení tlaku v iontovém zdroji. Chromatogram se získal zapisováním celkového iontového proudu chromatografickým zapisovačem při elektronové energii 20 eV, tj. pod ionizační energií He (24 eV). Rychlost snímání spektra byla nastavena na 2 nebo 3 sekund za dekádu což bylo postačující, protože látka se z náplňové kolony eluuje přibližně 20 sekund. Během vlastního měření spektra se elektronová energie automaticky zvýšila na 70 eV. Snímání spekter bylo prováděno manuálně v oblasti kolem maxim píků, kde se koncentrace látek málo mění. Ukázalo se, že 20 sekund eluování látky postačuje na to, aby se za tu dobu u vybraných píků provedlo měření přesných hmot. Před měřením byl přístroj seřízen na rozlišovací schopnost 5000, na osciloskop nastaven magnetem pík standardu a na dekádě urychlovacího napětí připravena přibližná hodnota přepočítávacího faktoru.

I když byl spektrometr MS902 se dvojitou fokusací a velkým urychlovacím napětí i rozlišením primárně určen pro standardní měření a měření při vysoké rozlišovací schopnosti byly technikou GS/MS změřeny stovky spekter a to zejména spekter těkavých přírodních látek z rostlin a hmyzu. Na tomto přístroji byly také poprvé v Československu technikou GC/MS identifikovány hmyzí feromony a nalezena přírodní nitrolátka, která byla desátou nitrolátkou celkově v přírodě identifikovaných (pozn. do současné doby jich bylo identifikováno celkem 11) – J. Vrkoč, K. Ubik, L. Dolejš., I. Hrdý: On the chemical composition of frontal gland secretion in termite of the genus Nasutitermes (N.costalis and N.rippertii; Isoptera) : Acta.entomol.bohem. 70, 74–80 (1973), J. Vrkoč, K. Ubik: 1-Nitro-trans-1-pentadecene as the Defensive Compounds of Termites, Tetraheron Lett. No.15, 163-1464 (1974).

ČSHS: Obrázek 1: Dobový záznam hmotnostního spektra na uv-citlivý papír

Po zakoupení spektrometru MS902 pracovaly v laboratoři současně spektrometry dva a počet pracovníků se rozrůstal. Statut hmotově-spektrometrická laboratoře se v průběhu let několikrát změnil. Nejprve byla jako skupina součástí Oddělení organické syntézy, potom součástí Oddělení přírodních látek a nejdelší období byla samostatným oddělením jako Centrální laboratoř hmotnostní spektrometrie. K této laboratoři byla také na několik let jako skupina přičleněna Centrální analytická laboratoř. V laboratoři se studovaly struktury celé řady přírodních i syntetických látek jako např. steroidů vč fytosterolů, alkaloidů, saponinů, fenolických látek, kutikulárních vosků z rostlin a hmyzu, terpenoidů, arylhydrazonů, dusíkatých heterocyklů, alkoholů aj.

Přestože byla změřena a studována hmotnostní spektra stovek látek, hlavním omezujícím faktorem přístroje však zůstávala jeho výlučná použitelnost pro elektronovou ionizaci, takže mohly být měřeny jenom relativně stabilní látky do hmotnosti přibližně 1 Da. Jako největší peptidická látka byl změřen permetylovaný hexapeptid. Permetylovaný saponin s hmotností 1274 Da byl látkou s největší hmotností na přístroji změřenou a bylo na to třeba snížit elektronovou energii na 40 eV a urychlovací napětí na 6 kV.

Revoluci v organické hmotnostní spektrometrii přinesl objev nových způsobů ionizace, především ionizace rychlými neutrálními částicemi (angl. FAB – Fast Atom Bombardment) a primárními ionty (angl. SIMS – Secondary Ion Mass Spectrometry). (Pozn. Technika SIMS se již dříve používala v anorganické hmotnostní spektrometrii, ale použitelná pro ionizaci organických látek se stala až po objevu matric.)

Nástup nových technik se podařilo včas zachytit. V roce 1984 se stal vedoucím laboratoře Karel Ubik a již v roce 1987 byl značným nákladem zakoupen hmotnostní spektrometr ZAB-EQ (VG Analytical, později Fisons a nyní Micromass, Manchester, UK). Dodavatel měl náročné podmínky na umístění citlivého přístroje, a proto musela být laboratoř znovu vybudována včetně nově udělané podlahy přímo se nedotýkající stěn. Pod celým spektrometrem ve tvaru L byl na odstranění vibrací vystavěn 20 cm vysoký blok skládající se z vrstev betonu, korku, olova a plastu. Náročné také bylo dovozní schvalovací řízení ze strany západních zemí, které prodej špičkové techniky do východního bloku omezovaly. Získání speciální licence musela schválit americká organizace COCOM. Rovněž byly problémy se schválením řídícího počítače DIGITAL, který měl na současnou dobu směšnou pevnou paměť jen 70 MB.

ČSHS: Obrázek 2: Fotoseriál (I) z úpravy laboratoře pro hmotnostní spektrometr ZAB-EQ

ZAB-EQ byl hybridní spektrometr s reverzní geometrií a konfigurací BEQQ, přičemž první Q označuje kvadrupól používaný jako kolizní cela. Ke spektrometru byl přímým vstupem připojen plynový chromatograf Hewlett-Packard 5890, který již používal křemenné kapilární kolony. Pro spojení s kapalinovým chromatogramem byl také k disposici systém pohyblivého polyimidovéo pásu s elektronovou ionizací, který se ale kvůli nestabilitě nanášení vzorků na pás neosvědčil.

ČSHS: Obrázek 3: Fotoseriál (II) z úpravy laboratoře pro hmotnostní spektrometr ZAB-EQ

Při základním urychlovacím napětí 8 kV měl spektrometr při dvojité fokusaci (BE) rozsah 10 kDa a kvadrupól měl rozsah 3 kDa. Jako ionizační techniky byly k disposici elektronová ionizace, chemická ionizace (ionizační plyny amoniak, metan, isobutan), ionizace rychlými neutrálními částicemi (argon při 8 kV), ionizace primárními ionty (Cs⁺ při 40 kV), termosprej pro spojení LC/MS. Nejpoužívanější byla elektronová ionizace a ionizace rychlými neutrálními částicemi. U obou jmenovaných způsobů ionizace se rutinně používalo měření při vysokém rozlišení na změření přesných hmot a tím elementárního složení vybraných iontů.

ČSHS: Obrázek 4: Fotoseriál (III) z úpravy laboratoře pro hmotnostní spektrometr ZAB-EQ

Pro zavádění vzorků k iontovým zdrojům se pro méně těkavé látky používal přímý vstup, přičemž kapaliny se dávaly do skleněných kapilár se zúženým koncem. Dávkování vzorku za pomocí malého rezervoáru (cca 70 ml) opatřeného septovým uzávěrem se používalo téměř výhradně pro standardní látky (perfluorokerosen, heptakoso-fluortributylamin), protože pokud by se méně těkavá kapalina v rezervoáru nevypařila nebyla možnost ji odstranit.

ČSHS: Obrázek 5: Karel Ubik u hmotnostního spektrometru ZAB-EQ

Spektrometr byl vybaven 4 kolizními celami a deflektorem. První kolizní cela byla v první oblasti bez pole. Dvě kolizní cely a mezi nimi deflektor (pro techniku neutralizace-reionizace) byly ve druhé oblasti bez pole. Čtvrtou celu tvořil kvadrupól na něhož bylo vloženo jenom vysokofrekvenční napětí a byl ve třetí oblasti bez pole. Spektrometr měl 3 detektory. První byl ve druhé oblasti bez pole za kolizními celami, druhý ve druhé oblasti bez pole před kvadrupólovou kolizní celou a třetí detektor byl na konci celého systému. Bylo tedy možno používat MS/MS techniku jak výběrem iontů magnetem, kolizí ve druhé oblasti bez pole a měřením produktů ve třetí oblasti bez pole tak při vysokém rozlišení za použití výběru iontů magnetem a elektrostatickým analyzátorem, provést kolize v kvadrupólové cele a produkty separovat kvadrupólem. Na spektrometru se měřila spektra všech tří typů, tj. spektra produktových iontů, spektra prekurzorů produktových iontů a spektra prekurzorů neutrálních ztrát. Kromě toho se měřila energetická spektra technikou MIKES – Mass Analyzed Ion Energy Spectroscopy.

Spojení GC/MS s kapilárními kolonami se používalo standardně a to i při vysokém rozlišení kdy byla doba snímání spektra nastavena na 1 sec za dekádu.

Po změně politického systému v zemi v roce 1989 přestaly západní země dovoz špičkové techniky ztěžovat a tak byl zastaralý řídící počítač vyměněn za řídící stanici Alpha Station. Pozoruhodné bylo, že firma VG Analytical provedla výměnu počítačových systému za půl dne. Nový hardware i software neobyčejně zvýšili efektivitu práce a kvalitu výstupů, nicméně byl systém stále udělán tak, že se ručně nastavily všechny parametry vč. rozlišení, parametrů iontového zdroje a fokusace a potom počítač převzal kontrolu vlastního měření. Řadu základních měření, ale ne všechna, bylo možno dělat manuálně a v případě poruch počítače, což se v případě původního počítače několikrát stalo, bylo možno spektra registrovat na UV-světlo citlivý papír.

Spektrometr ZAB-EQ a jeho příslušenství otevřelo ve hmotnostní spektrometrii novou dimenzi pro strukturní analýzy. Bylo to např. měření netěkavých látek až do hmotnosti cca 6 kDa, které se jinak v EI zdrojích teplem rozkládají, zatímco při FAB a SIMS se dostávají do plynného stavu až ve formě iontů, dále rutinní používání kolizí indukovaných spekter stejně tak jako různých MS/MS technik a měření při vysokém rozlišení i pro FAB měření. Byly tedy studovány struktury takových látek jako jsou např. nukleosidy a jejich modifikace, glykosidy přírodních látek jako jsou např. saponiny a flavonoidy, ekdysteroidy, kobaltové sendviče substituovaných karboranů (cosany) a zejména pak byly měřeny volné peptidy a to až do inzulínů s hmotností kolem 5800 Da.

I když spektrometr ZAB-EQ svými parametry hmotnostní spektrometrii v ústavu významně posunul dopředu, přesto zůstávala řada organických látek tímto přístrojem neanalyzovatelná. Proto byla v roce 2002 zakoupena komplexní hmotově spektrometrická jednotka. Základní částí je hmotnostní reflexní spektrometr REFLEX IV (Bruker Daltonics, Leipzig, D) pracující na principu pulzní ionizace laserem a separace iontů na základě měření jejich doby letu, tj. MALDI/TOF. Způsob ionizace a měřící rozsah hmotností v řádu desítek až stovek Da umožňuje studium primární struktury proteinů a měření vysokomolekulárních látek jako jsou oliginukleotidy, či sacharidy.

Součástí jednotky jsou dále vyřezávač gelů (angl. spot picker) a štěpící stanice pro analýzu proteinů (Proteineer DP). Oba tyto pomocné přístroje mají svoje řídící stanice a stanice všech tří přístrojů jsou propojeny. Analýza probíhá tak, že ve vyřezávači se na gelu z dvourozměrné elektroforézy nejprve vyberou proteiny, které je zájem identifikovat a gely se v paměti počítače označí. Toto označení zůstává pro každý protein totožné až do změření ve spektrometru. Následuje automatické vyřezání gelů s proteiny a přenesení do mikrozkumavek nosiče. Nosiče s vyřezanými gely s proteiny se umístí do štěpící stanice kde je sada chemikálií pro štěpení (štěpící činidlo je obvykle trypsin) a na pozdější měření (matrice) a také nosič s terčíky připravenými na nanesení matrice s jednotlivými proteiny. Štěpení probíhá automaticky po dobu asi 8 hodin. Při enzymatickém štěpení se proteiny štěpí na peptidy s hmotností do 3 kDa. Na konci štěpení jsou směsi peptidů spolu s matricí automaticky naneseny na terčíky nosiče vzorků. Nosič vzorků se umístí do iontového zdroje spektrometru, nastaví se parametry a spustí automatické skenování, které probíhá několik hodin. Získaná spektra se ručně nebo automaticky porovnávají se spektry známých proteinů v různých databázích. Pokud se objeví zcela neznámý protein tak je možno k získání fragmentových iontů použít techniku disociace iontů po opuštění iontového zdroje (angl. PSD – Post-Source Dacay) příp. získat větší množství fragmentových iontů zpožděnou extrakcí iontů z iontového zdroje (angl. ISD – In Source Decay) a tím umožnit aby ionty disociovaly již ve zdroji.

Časem se při analýze proteinů ukázalo, že srovnávání spekter peptidů vzniklých štěpení proteinů s databázemi není postačující, protože i rozdílné proteiny mohou poskytnout podobnou směs peptidů. A tak nastupuje Orbitrap.