Použití vodíku jako nosného plynu pro GC/MS/MS analýzu steroidů v moči za méně než 10 minut

Úvod 

Anabolické androgenní steroidy (AAS) jsou třída steroidních hormonů příbuzných testosteronu. Testosteron se přirozeně vyskytuje v lidském těle a je vylučován především ve formě konjugátu s glukuronidem nebo sulfátem. AAS vykazují jak androgenní účinky spojené s maskulinizací a virilizací, tak anabolické účinky spojené se syntézou bílkovin a růstem svalů. Navzdory probíhající debatě o jejich účinnosti a potenciálních rizicích je užívání AAS rozšířené v silových sportech pro zvýšení svalové hmoty a ve vytrvalostních sportech pro lepší regeneraci. Kromě toho mohou různé nepřímé strategie steroidního dopingu podobně zvýšit hladinu testosteronu, což komplikuje detekci a regulaci dopingových praktik.

U exogenních i endogenních steroidů používají antidopingové laboratoře jako první krok počáteční testovací postupy (ITP) k identifikaci podezřelých nálezů a potvrzovací metodu (CP) k potvrzení těchto nálezů. 

Tento proces analýzy vzorků v antidopingové laboratoři lze shrnout do několika kroků: 

1. Do laboratoře dorazí anonymní (kódovaný) vzorek (rozdělený na vzorky A a B). Vzorek A se otevře a odebere se z něj alikvotní část. Vzorek B zůstává zapečetěný a je okamžitě uložen do mrazáku. 

2. Extrakce vzorku se provádí pomocí alikvótní části vzorku A. Po extrakci se vzorek nastříkne do systému GC/Q-TOF. Další podrobnosti lze nalézt v předchozí aplikační poznámce.² Kvantifikace endogenních AAS se provádí pomocí tohoto systému a hodnoty se hlásí příslušným orgánům. 

3. Orgány odpovědné za odběr vzorků zadají své údaje do databáze WADA, což umožní propojení kódu vzorku s konkrétním sportovcem. Následně se provede vyhodnocení nově naměřených koncentrací ve srovnání s koncentracemi získanými z předchozích vzorků dopingové kontroly tohoto sportovce. Pokud tyto koncentrace z ITP neodpovídají očekávaným rozmezím, orgány upozorní laboratoř, že původně nahlášené hodnoty je třeba potvrdit. 

4. Pro potvrzení se analyzuje druhá alikvotní část vzorku A metodou popsanou v této aplikační poznámce. 

5. Pokud druhá analýza potvrdí výsledky ITP, provede se obvykle IRMS analýza vzorku A, aby se zjistilo, zda je původ AAS přírodní nebo pochází z farmaceutického přípravku. 

6. Pokud sportovec nesouhlasí s pozitivním výsledkem IRMS, lze požádat o novou analýzu nedotčeného vzorku B. 

Naše předchozí aplikační poznámka popisovala "multitarget" metodu GC/Q-TOF pro ITP.² Nově vyvinutá metoda s pouřitím vodíku (H₂) představená v tomto dokumentu se používá při potvrzení výsledků z ITP. Trojitý kvadrupól GC/MS/MS³ a vysokorozlišovací GC/Q-TOF⁴ jsou nezbytné techniky, zejména pro kvantifikaci AAS a separaci stereoizomerů, které techniky jako je LC/MS často nedokážou rozlišit. Tradičně se jako nosný plyn pro GC/MS analýzy používá helium (He) díky svým optimálním vlastnostem. Nicméně globální nedostatek helia však vyvolal potřebu hledat vhodné alternativy, aby byla zajištěna kontinuita a spolehlivost analytických měření.

Vodík může mít oproti heliu jako nosnému plynu v GC/MS několik výhod, včetně toho, že je lépe dostupný a výrazně levnější než helium. Vodík lze také vyrábět udržitelným způsobem elektrolýzou vody za použití zelené elektřiny, což z něj činí ekologičtější variantu. Vodík navíc udržuje zdroj elektronové ionizace (EI) během provozu čistší, čímž snižuje nároky na údržbu a zvyšuje provozuschopnost přístroje a produktivitu laboratoře.

Tato aplikační poznámka představuje vyvinutou a ověřenou GC/MS/MS metodu pro účinné a spolehlivé měření 14 endogenních AAS v moči pomocí elektronové ionizace s vodíkem jako nosným plynem. Výkonnost metody byla zachována a splňovala stejné LOI jako metoda používající jako nosný plyn helium. Možnost přechodu na vodík jako nosný plyn v aplikacích GC/MS/MS poskytuje antidopingovým laboratořím robustní alternativu, která zajišťuje kontinuitu vysoce kvalitních analytických výsledků i přes problémy s dodávkami helia.

Experimentální část

Vzorky

K přípravě vzorků a extrakci z moči byl použit automatizovaný přístroj Biotage pro extrakci v pevné fázi (SPE). Odpařování rozpouštědla v bezkyslíkatém dusíku (OFN) bylo provedeno pomocí přístroje Biotage TurboVap. Každá analytická šarže obsahovala:

• Vzorky, které měly být analyzovány ve dvojím provedení (jedna alikvotní část s SPE a hydrolýzou a jedna alikvotní část bez SPE a hydrolýzy)
• Systémový slepý vzorek
• Kalibrační křivku
• Vzorky pro kontrolu a zajištění kvality

Vzorky byly před analýzou GC/MS/MS derivatizovány derivatizační směsí MSTFA/NH₄I/ethanethiol (500:4:2).

Analýza GC/TQ

Pro analýzu byl použit systém Agilent 7000C triple quadrupole GC/MS (GC/TQ). Provozní parametry přístroje jsou uvedeny v tabulce 2. Další informace a osvědčené postupy pro použití H₂ jako nosného plynu naleznete v uživatelské příručce Helium to Hydrogen Carrier Gas Conversion User Guide.⁵ Vzhledem k tomu, že se jednalo o cílenou analýzu a žádný z cílových analytů nevykazoval reaktivitu s vodíkrm jako nosným plynem, byl použit standardní zdroj Agilent Inert Plus EI. Pro analýzu neznámých látek nebo při analýze sloučenin, které jsou náchylné k interakci s vodíkem, lze zvážit použití zdroje Agilent HydroInert.

Agilent Technologies: Tabulka 2. Podmínky GC a MS pro forenzní toxikologickou analýzu

Předchozí metoda GC/MS/MS s pozitivní chemickou ionizací (PCI) používající jako nosný plyn helium používala split 5:1.⁶ Při převodu analýzy s nosným plynem vodíkem je však běžné pozorovat 2 až 5násobný pokles citlivosti. Pro kompenzaci snížené citlivosti lze upravit splitovací poměr nebo nastřikovaný objem vzorku. V této nově vyvinuté metodě využívající vodík jako nosný plyn bylo použit splitless nástřik, aby byla zachována dostatečná citlivost a srovnatelnost s předchozí metodou.

Sběr a zpracování dat bylo provedeno pomocí softwaru Agilent MassHunter pro systémy GC/MS (verze 10.2) a softwaru Agilent MassHunter Quantitative Data Analysis (verze 10.2).

Kalibrační křivky pro 14 steroidů obsahovaly po šesti bodech a byly připraveny přidáním steroidů do vzorků stripované moči. Kalibrační úrovně jsou uvedeny v tabulce 3. Každá kalibrace byla provedena třikrát, což vedlo k 18 kalibračním bodům na šesti úrovních. Pro kalibraci vnitřních standardů byly použity deuterované vnitřní standardy (ISTD). Pro kalibraci všech sloučenin byla použita kvadratická aproximace. Na kalibrační křivky byl aplikován váhový faktor 1/x.

Validace metody

Pro posouzení externí odchylky bylo také analyzováno 18 vzorků moči s odpovídající matricí z externího programu hodnocení kvality (EQAS) WADA a byly vypočítány z-skóre pro šest sloučenin.

Výsledky a diskuse

Tato představená metoda s použití vodíku jako nosného plynu zkrátila dobu analýzy na méně než 10 minut, aniž by došlo ke snížení chromatografického rozlišení izomerů. Je třeba poznamenat, že původní metoda GC/MS/MS s héliem jako nosným plynem vyžadovala dobu analýzy 17 minut.⁶ Přechodem na vodík jako nosný plyn a použitím vhodných rozměrů kolony lze tedy dobu analýzy zkrátit o více než 40 %. Obrázek 1 ukazuje celkový iontový chromatogram v režimu vícenásobného monitorování reakcí (MRM) pro obě metody, při použití hélia jako nosného plynu (A) nebo vodíku jako nosného plynu (B).

Agilent Technologies: Obrázek 1. MRM chromatogram s (A) héliem a (B) vodíkem

EI zdroj s nosným plynem vodíkem

Při přechodu z helia na vodík jako nosný plyn je v GC/MS důležitým faktorem spektrální věrnost. Některé aktivní sloučeniny mohou reagovat s vodíkem, což vede ke spektrálním změnám. To je důležité nejen pro GC/MS v režimu sběru skenovaných dat, ale také pro GC/MS/MS v režimu MRM, protože tyto spektrální změny mohou ovlivnit prekurzorové ionty. To může vést ke ztrátě citlivosti a problémům s kalibrací. Pokud se takové problémy vyskytnou, lze je účinně vyřešit použitím zdroje HydroInert, který minimalizuje interakce mezi vodíkem a analyzovanými látkami, zachovává spektrální integritu a zajišťuje spolehlivé a přesné výsledky.⁷ Ne všechny sloučeniny reagují s vodíkem, a proto mnoho z nich nevykazuje spektrální změny s nosným plynem vodíkem, ani když se používá standardní zdroj EI. Pro dosažení nejlepšího výkonu při použití konvenčního zdroje EI s vodíkem lze také vyměnit čočku za 9mm čočku.

V této práci cílové sloučeniny nevykazovaly reakce s vodíkem ve zdroji při použití zdroje Inert Plus EI se standardní 3mm extraktorovou čočkou. Pro potvrzení absence nežádoucích chemických interakcí mezi cílovými analyty a nosným plynem vodíkem byla spektra získána s nosným plynem heliem a vodíkem pomocí standardního zdroje Inert Plus EI vybaveného 3mm čočkou. Obrázek 2 ukazuje hmotnostní spektra pro 5b-androstanediol-d5, jeden z deuterovaných interních standardů, získaná pomocí nosných plynů helia nebo vodíku. Spektra pro čtyři další deuterované interní standardy jsou uvedena v příloze na obrázcích A1 až A4. U všech hodnocených sloučenin nebyly pozorovány žádné spektrální změny, což naznačuje, že pro tuto analýzu lze použít standardní zdroj Inert Plus EI s 3mm extraktorovou čočkou.

Agilent Technologies: Obrázek 2. EI hmotnostní spektra

Bylo zjištěno, že derivatizované steroidy analyzované v této studii nevykazovaly žádné znatelné spektrální změny, ani když byl použit konvenční zdroj Inert Plus s nosným plynem vodíkem. To lze připsat procesu derivatizace, protože derivatizační činidlo přeměňuje analyty na stabilnější deriváty a maskuje funkční skupiny, které by jinak mohly interagovat s nosným plynem - vodíkem. Tím se snižuje pravděpodobnost rozkladu nebo vedlejších reakcí.

Kvantifikace 14 steroidů v moči

Tabulka 3 uvádí kalibrační rozsahy a korelační koeficienty pro 14 steroidů, které vyžadují kvantifikaci podle WADA. Endogenní anabolické steroidy kvantifikované v této práci patří mezi analyticky nejnáročnější sloučeniny. Na jedné straně je to dáno jejich nízkými LOI, na druhé straně však mohou problémy vzniknout v důsledku nutnosti jejich přesné kvantifikace při vysokých koncentracích. Při použití této metody byly korelační koeficienty (R²) u všech 14 analytů vyšší než 0,997.

Agilent Technologies: Tabulka 3. Retenční čas, kalibrační koeficienty, hodnoty R2 a interní standardy (ISTD) použité pro 14 steroidů vyžadujících kvantifikaci podle WADA.

Validační studie

V rámci programu EQAS WADA jsou vzorky moči často zasílány do akreditovaných laboratoří.⁴ Za tímto účelem bylo analyzováno šest analytů v 18 vzorcích EQAS a naměřené hodnoty byly porovnány s hlášenými konsensuálními hodnotami. U všech 108 hodnot byly z-skóre nižší než 1, což naznačuje, že tato metoda poskytuje dostatečnou přesnost.

Závěr

Pro analýzu 14 anabolických steroidů v moči byla vyvinuta GC/MS/MS metoda s elektronovou ionizací (EI) za použití vodíku jako nosného plynu. Byla prokázána vynikající kalibrační výkonnost v rozšířeném kalibračním rozsahu pokrývajícím minimální požadované výkonnostní úrovně (MRPL). Tato analýza mohla být provedena za méně než 10 minut, což je o 40 % rychleji než původní metoda GC/MS/MS s pozitivní chemickou ionizací (PCI). Validace WADA prokázala, že u všech analyzovaných vzorků byly z-skóre nižší než 1, což naznačuje přijatelnou přesnost metody.