Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

Extrakce na pevné fázi (SPE) je běžně volenou metodou přípravy vzorků před analýzou pomocí HPLC a GC. Poskytuje:

• Čištění vzorku;
• Předkoncentraci analyzované látky;
• Výměnu rozpouštědla.

Tato metoda dobře funguje pro homogenní kapalné vzorky, avšak je zřejmé, že pevný vzorek nelze přímo aplikovat na SPE zařízení. V tomto textu se zaměříme na to, jak nejlépe přistupovat k přípravě pevných vzorků před SPE.

První fáze předúpravy vzorku zahrnuje homogenizaci pevného vzorku s vhodným rozpouštědlem. Vybrané rozpouštědlo by mělo:

• Účinně rozpouštět analyt;
• Účinně rozpouštět matrici vzorku (i když to není nezbytné, pokud je vzorek dobře promíchán s rozpouštědlem);
• Ideálně být slabým rozpouštědlem z pohledu následující SPE fáze. To však nemusí být vždy možné, a proto může být nutné vzorek vysušit a následně rekonstituovat před aplikací na SPE kolonu.

Po vytvoření suspenze vzorku ve vhodném rozpouštědle by měl být vzorek promíchán na vortexu pro důkladné promísení a následně centrifugován, aby se usadily nerozpustné složky matrice. Supernatant (kapalná fáze) se poté oddělí a dále zpracovává.

V tomto okamžiku je nutné zvolit odpovídající SPE mechanismus:

Metoda reverzní fáze SPE

Mechanismus / slabé rozpouštědlo / silné rozpouštědlo

• Reverzní fáze – voda/pufr – acetonitril/methanol (nejsilnější je hexan)
• Normální fáze – hexan/heptan – středně polární organická rozpouštědla, jako je DCM, MTBE, IPA (nejsilnější je voda)
• Iontová výměna – vodný pufr s pH, které podporuje iontové výměnné interakce mezi analyzovanou látkou a sorbentem SPE – organické rozpouštědlo, obvykle methanol s úpravou pH pro narušení iontových výměnných interakcí.

V tomto bodě je třeba vzít v úvahu jak vlastnosti analytu, tak i rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku. Extrakce na reverzní fázi je účinná pro středně polární až středně hydrofobní analyty, ale pouze pokud jsou rozpuštěny ve slabém rozpouštědle, např. ve vodě. Pokud je vzorek rozpuštěn ve středně polárním rozpouštědle, je třeba jej buď zředit, nebo vysušit a rekonstituovat. Totéž platí pro normální fázi, kdy musí být vzorky rozpuštěny v hexanu nebo heptanu, aby bylo dosaženo účinné retence analytu během nanášení vzorku na SPE zařízení.

Následující příklady mají tento princip ilustrovat:

Extrakce PCB z půdy

PCB jsou hydrofobní a dobře se rozpouštějí v nepolárních rozpouštědlech. Zeminu lze vysušit, zvážit a extrahovat pomocí hexanu nebo heptanu. Po důkladném promíchání a centrifugaci lze získaný roztok aplikovat přímo na kondicionovanou SPE kolonku se silikagelem, čímž se provede extrakce na  normální fázi.

Tylosin z masa

Tylosin je antibiotikum s hodnotou log P = 1,0. Extrakcí masa směsí acetonitrilu a vody (80:20) dojde k narušení hydrofobních interakcí a uvolnění tylosinu. Po centrifugaci bude nutné další naředění vodou, aby se snížila síla rozpouštědla před extrakcí na reverní fázi.

Enilkonazol z pomerančů

Enilkonazol je fungicid běžně používaný v zemědělství, zejména u citrusových plodů. Lze jej snadno extrahovat z pomerančů pomocí acetonitrilu. Jelikož je enilkonazol zásaditý, přidání HCl do acetonitrilového extraktu podpoří protonaci analytu, což umožní jeho přímou retenci na SPE sorbentu se silnými katexovými vlastnostmi (SCX). Tento postup výrazně zjednodušuje extrakci, protože není potřeba žádné ředění vzorku (na rozdíl od extrakce na reverzní nebonormální fázi, kde by 100% acetonitril způsobil, že by se analyt během nanášení nezachytil).