STANOVENÍ NERVOVĚ PARALYTICKÝCH LÁTEK V BIOLOGICKÝCH VZORCÍCH

Příspěvek ze sborníku příspěvků z XXIV. ročníku mezinárodní konference o separační chemii a analýze toxických látek 2024

STANOVENÍ NERVOVĚ PARALYTICKÝCH LÁTEK V BIOLOGICKÝCH VZORCÍCH

ALŽBĚTA DLABKOVÁ^a*, LUKÁŠ PRCHALA^b, HELENA ŘEHULKOVÁ^a

a Katedra toxikologie a vojenské farmacie, Vojenská lékařská fakulta, Univerzita obrany, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové, [email protected]

b Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Sokolská 581, 500 02, Hradec Králové, [email protected]

• Celý Sborník příspěvků z XXIV. ročníku mezinárodní konference o separační chemii a analýze toxických látek ke stažení ZDE

ABSTRAKT:

Nervově paralytické látky jsou toxické látky, jejichž účinek je založený na ireverzibilní inhibici cholinesteras. Jedná se o jedny z nejtoxičtějších chemických bojových látek, které jsou uvedeny na seznamu I.A přílohy Úmluvy o zákazu chemických zbraní. Mezi přístupy k detekci a stanovení nervově paralytických látek v biologických vzorcích patří stanovení peptidových aduktů získaných rozštěpením inhibované plazmatické butyrylcholinesterasy, stanovení tyrosinových aduktů, stanovení fluoridem regenerovaných nervově paralytických látek a stanovení alkyl metylfosfonových kyselin vzniklých hydrolýzou těchto látek. K tomuto účelu se nejčastěji využívají vzorky plazmy, méně moči. Nejčastěji využívanou analyticko-chemickou technikou je kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií, fluoridem regenerované látky a alkyl metylfosfonové kyseliny lze stanovit rovněž pomocí plynové chromatografie.

KLÍČOVÁ SLOVA: nervově paralytické látky, cholinesterasy, biomarkery, plazma, moč

1. ÚVOD

Nervově paralytické látky (NPL) jsou toxické látky, jejichž účinek je založený na ireverzibilní inhibici enzymu acetylcholinesterasy (AChE) prostřednictvím fosforylace katalytického místa enzymu, což vede k hromadění acetylcholinu na nervové synapsi a hyperexcitaci neuronu. Jedná se o jedny z nejtoxičtějších chemických bojových látek, které jsou uvedeny na seznamu I.A přílohy Úmluvy o zákazu chemických zbraní (Convention on the Prohibition of the Development, Production, Stockpiling and Use of Chemical Weapons and on their Destruction)[1].
Zlatým standardem v laboratorním stanovení NPL je plynová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC-MS). V posledních letech se dostává do popředí stanovení pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS). Diagnostika otravy NPL, v případě podezření na zasažení organizmu, se zakládá na posouzení symptomů, doplněném o vyšetření aktivity krevních cholinesteras, což však neumožnuje identifikaci konkrétní NPL ani odlišení otravy NPL od otravy organofosforovým pesticidem. K těmto účelům nejlépe poslouží právě zmíněné chromatografické techniky.

Stanovení nervově paralytických látek v biologickém materiálu, nejčastěji v plazmě a moči, má však svá specifika. Vzhledem k tomu, že se jedná o látky velmi toxické, tedy účinné již ve velmi malých dávkách, očekává se v biologickém materiálu výskyt velmi malých koncentrací – řádově jednotky ng/ml, což odpovídá pmol/ml. Vzhledem ke značné reaktivitě a nestabilitě těchto látek navíc nelze předpokládat detekci přímo originální toxické látky, proto je třeba zaměřit se na hledání jejích metabolitů, degradačních produktů nebo aduktů s biologickými molekulami. Další omezení vyplývá z podstaty biologických matric, což jsou komplexní směsi obsahující řadu organických i anorganických látek, jejichž koncentrace značně převyšuje koncentraci analytů. Navíc, zejména v případě plazmy a jiných krevních derivátů, bývá k dispozici pro analýzu pouze omezené množství vzorku.

Mezi nejčastější přístupy k detekci a stanovení NPL v biologickém materiálu pomocí chromatografických metod patří stanovení peptidových aduktů získaných rozštěpením inhibované plazmatické butyrylcholinesterasy (BChE), stanovení tyrosinových aduktů, stanovení fluoridem regenerovaných NPL a stanovení kyselin vzniklých hydrolýzou NPL[2].

2. STANOVENÍ BUTYRYLCHOLINESTERASOVÝCH ADUKTŮ

V krevní plazmě se NPL vážou do aktivního místa přítomného enzymu BChE (nazývaného též pseudocholinesterasa) a podobně jako AChE jej ireverzibilně inhibují. Toho lze využít k průkazu otravy NPL. Kromě toho, že lze vyšetřit aktivitu plazmatické BChE např. pomocí Ellmanovy reakce, a tím podpořit diagnostiku otravy, ovšem bez možnosti identifikace konkrétní otravné látky, je možné specifické stanovení fosforylovaných peptidů získaných štěpením inhibované BChE. Postup úpravy vzorku spočívá v izolaci BChE od ostatních plazmatických proteinů, např. imunomagnetickou separací nebo na prokainamidovém gelu, její enzymatické digesci (např. s využitím pepsinu) a ultracentrifugaci. Po té je možná HPLC-MS analýza cílená na stanovení nonapeptidů Phe-Gly-Glu-Ser198-Ala-Gly-Ala-Ala-Ser s navázanou NPL, vyštípnutých z inhibovaného aktivního místa enzymu[3–6]. Komplex inhibovaného enzymu a NPL podléhá procesu tzv. stárnutí, při němž dochází k dealkylaci esterové skupiny NPL. Nejrychleji ke stárnutí dochází u cholinesteras inhibovaných somanem, pomaleji pak u cyklosarinu, sarinu a tabunu[7]. To vede k nutnosti stanovovat nonapeptidové adukty NPL v jejich zestárlé (dealkylované) i původní nezestárlé formě. BChE peptidové adukty NPL lze dekovat a identifikovat až 16 dní po expozici[3].

3. STANOVENÍ TYROSINOVÝCH ADUKTŮ

NPL nefosforylují pouze aktivní místa AChE a BChE ale i další přístupné hydroxylové skupiny plazmatických bílkovin. Největší zastoupení z nich má albumin, který tvoří přibližně 60 % proteinů přítomných v krevní plazmě. Na albumin se NPL váží na tyrosin v pozici 411, a tento komplex, na rozdíl od výše zmíněného komplexu NPL a BChE, nepodléhá stárnutí. Toho lze využít ke stanovení specifických tyrosinových aduktů NPL v nezestárlé formě. Je ovšem třeba brát v úvahu, že albumin reaguje s NPL až pětinásobně pomaleji ve srovnání s cholinesterasami[8]. Úprava vzorku je založená na precipitaci proteinů vhodným deproteinačním činidlem, např. acetonem a následné enzymatické digesci proteinů vhodným enzymem, nejčastěji pronasou nebo proteinasou K. Vzhledem k vysoké koncentraci albuminu jej není nutné předem izolovat. Po digesci následuje přečištění vzorku pomocí extrakce na pevných fázích (SPE, z angl. solid phase extraction). Koncentrace analytu nebývají vysoké, proto je vhodné eluát získaný SPE odpařit a rozpustit v menším objemu rozpouštědla, čímž dojde ke zkoncentrování vzorku. V takto upravených vzorcích lze tyrosinové adukty NPL stanovit pomocí HPLC-MS.

HPLC analýza je možná v uspořádání na reverzních fázích, na C18 stacionární fázi, MS nebo MS/MS detekce v pozitivním modu[8–11].

4. STANOVENÍ FLUORIDEM REGENEROVANÝCH NPL

Zatímco dva výše zmíněné markery expozice NPL je lepší stanovit z plazmy, fluoridovou regeneraci lze použít pro průkaz NPL v plazmě i v plné krvi. Tento postup je založen na faktu, že NPL je možné „obnovit“ z vazby na cholinesterasy v prostředí s dostatečnou koncentrací fluoridových iontů. Vzorek plazmy nebo krve se nejprve inkubuje s 2M fluoridem draselným v kyselém prostředí (octanový pufr pH 3,5), po té se regenerovaná látka extrahuje. Je možná kapalinová extrakce (LLE, z angl. liqiud-liquid extraction) do nepolárního rozpouštědla, která je vhodná především pro následnou GC-MS analýzu, nebo SPE na reverzních fázích[12,13]. Stanovení pomocí HPLC je možné především s použitím derivatizace NPL pomocí 2-[(dimethylamino)methyl]fenolu, který ochotně tvoří s NPL stabilní sloučeniny, které na MS detektoru dobře ionizují[14,15]. Tím se předejde hydrolýze regenerovaných látek a zároveň se zvýší citlivost analýzy.

5. STANOVENÍ ALKYL METYLFOSFONOVÝCH KYSELIN

Alkyl metylfosfonové kyseliny (AMPK) jsou produkty hydrolýzy NPL. V krvi mohou být detekovány volné, rozpuštěné v plazmě (séru). V takovém případě jsou z hlediska průkazu otravy NPL považovány za tzv. sekundární biomarkery, které mohou sloužit k potvrzení nálezu NPL některou z výše popsaných metod (viz body 2 – 4), ale samy o sobě otravu NPL jednoznačně neprokazují. AMPK však mohou být stanoveny rovněž po uvolnění z plazmatických proteinů, ke kterému dojde po reakci s vhodným oximovým reaktivátorem. Oximové reaktivátory byly vyvinuty jako specifická kauzální antidota při otravách NPL a jinými ireverzibilními inhibitory cholinesteras. Tyto látky jako silné nukleofily atakují inhibované aktivní místo enzymu, odštěpí NPL a obnoví tak jeho aktivitu[16]. Následně se komplex reaktivátor – NPL rozpadá za uvolnění AMPK. Pokud je příprava vzorku plazmy specifická pro stanovení takto uvolněných AMPK, mohou být považovány za tzv. primární biomarkery, mohou tedy sloužit k průkazu expozice NPL. V neposlední řadě je možné nalézt a stanovit AMPK, jako jedinou ze známek přítomnosti NPL v organizmu, v moči. Na rozdíl od ostatních se totiž jedná o malé molekuly dobře rozpustné ve vodě.

Úprava vzorku plazmy spočívá nejprve v inkubaci s oximovým reaktivátorem, při níž dojde k uvolnění AMPK vázaných na přítomnou BChE[2], po té v precipitaci proteinů. Vzorek lze přečistit po použití SPE nebo LLE, extrakci však komplikuje polární charakter molekuly. Je možné využít SPE na tzv. normálních fázích, tedy na polárním sorbentu[17], nebo LLE po okyselení vzorku. Účinnost LLE zvýší přidání bezvodého síranu sodného v nadbytku[18]. Vzorek moči je možné upravit pouze naředěním, anebo lze opět využít SPE či LLE. Takto připravené vzorky se analyzují přímo HPLC-MS[17] nebo po vhodné derivatizaci (nejčastěji s užitím pentafluorobenzylbromidu[19] nebo sililačních činidel[20]).

Jako polární molekuly vykazují AMPK nedostatečnou retenci při HPLC na reverzních fázích, pro jejich analýzu je tedy vhodné použít hydrofilní interakční chromatografii (HILIC, z angl. hydrophylic interaction chromatography)[17,18]. Kolony určené pro HILIC obsahují hydrofilní sorbent, na němž se imobilizuje vodná složka mobilní fáze, což umožňuje lepší zadržování polárních analytů. Vzhledem k tomu, že se jedná o kyseliny, pro MS detekci je výhodnější negativní mód.

6. ZÁVĚR

Pro průkaz expozice živého organizmu NPL je zavedeno stanovení několika biologických markerů, které je možné detekovat v biologických materiálech. K tomuto účelu se nejčastěji využívají vzorky plazmy, méně moči. Na rozdíl od průkazu NPL v environmentálních vzorcích je nejčastěji využívanou analyticko-chemickou technikou HPLC-MS, protože některé biomarkery, zejména peptidové a aminokyselinové adukty, nejsou svým charakterem vhodné pro GC stanovení a zbývající, fluoridem regenerované NPL a kyseliny vzniklé hydrolýzou NPL, lze stanovit oběma technikami. V současnosti se do popředí zájmu dostávají NPL nové generace, které byly na seznam I.A přílohy Úmluvy o zákazu chemických zbraní přidány v roce 2020. Tyto látky se od déle známých a lépe prozkoumaných liší řadou svých chemických vlastností. S tím přichází potřeba ověřit vhodnost dosud zavedených metod stanovení NPL v biologických vzorcích i pro tyto nově přidané látky, případně dosud používané metody revidovat.