Simultánní analýza obsahu alkoholu v krvi na dvou kolonách s využitím dusíku jako nosného plynu na systému Brevis GC-2050

Výhody pro uživatele

• Plynová chromatografie se simultánním využitím dvou kolon, kdy jsou propojeny dvě kolony s odlišnými separačními vlastnostmi, zlepšuje kvalitativní výkonnost analýzy.
• Systém Brevis GC-2050 umožňuje využít jako nosný plyn dusík – levnou alternativu k héliu – pro analýzu těkavých organických látek (VOC) v krvi při zachování dobrého rozlišení.
• Kompaktní konstrukce přístroje Brevis GC-2050 šetří místo v laboratoři.

Úvod

Analýza obsahu alkoholu v krvi (BAC) a dalších těkavých organických látek (VOC) je nezbytná pro orgány činné v trestním řízení při určování alkoholové intoxikace a její role při dopravních nehodách, napadeních a úrazech, stejně jako pro objasnění příčin určitých trestných činů či otrav.

Tato analýza se obvykle provádí pomocí plynového chromatografu (GC) vybaveného headspace dávkovačem (HS) a plamenově ionizačním detektorem (FID). Protože se u BAC analýz požaduje vysoká přesnost, používají se dvě kolony s odlišnými separačními vlastnostmi, které umožňují vzájemné ověření výsledků. Použitím integrovaného systému HS-GC se dvěma FID detektory připojenými k dvoukolonové konfiguraci lze ověřovací analýzu provést v jediné analýze. Kolony jsou připojeny přímo na přenosovou kapiláru pomocí ferule se dvěma otvory, čímž se minimalizují ztráty vzorku adsorpcí.

Kromě špičkového systému Nexis GC-2030 nabízí společnost Shimadzu také kompaktní plynový chromatograf Brevis GC-2050. V této aplikační zprávě byl použit spolu s headspace dávkovačem HS-20 NX (obr. 1) pro analýzu BAC.
V obdobném experimentu (Aplikační zpráva 01-00570) byl jako nosný plyn použit vodík; zde byl zvolen dusík jako levnější alternativa. Protože dusík obvykle negativně ovlivňuje separaci, byly v tomto experimentu testovány separační podmínky pro 10 různých těkavých látek z krve.

Shimadzu: Obr. 1 Brevis GC-2050 a HS-20 NX (speciálně navržená prostorově úsporná transfer line pro GC-2050)

Nastavení přístroje

V experimentu byl použit systém GC-2050 vybavený dvěma FID detektory a dvěma kolonami s odlišnými separačními charakteristikami, propojený s HS dávkovačem (obr. 2). Tato duální konfigurace umožňuje současnou analýzu, zlepšuje kvalitativní výkon i produktivitu.

Shimadzu: Obr. 2 Schematické znázornění systému HS-GC s dvojitou kolonou

Pro analýzu byly použity kolony SH-BAC PLUS1 (30 m × 0,32 mm I.D., 1,8 µm) a SH-BAC PLUS2 (30 m × 0,32 mm I.D., 0,6 µm), které jsou vhodné pro stanovení obsahu alkoholu v krvi.

Seznam spotřebního materiálu potřebného pro simultánní analýzu na dvou kolonách je uveden níže a moduly pro připojení kolon pro HS spojení jsou znázorněny na obr. 3. Každá kolona byla připojena k omezovací trubici (vnitřní průměr 0,22 mm, délka 100 mm) pomocí sady SMI Union Kit (0,4–0,5 mm). Sada matic HS konektoru obsahovala 1/16” FITTINGS GVF16(2)-004 10/PK a 1/16” MALE/FEMALE CONNECTOR. Pro vzorkovou smyčku HS-20 NX byla použita smyčka 0,5 ml (P/N: 225-21889-85).

Shimadzu: Obr. 3 Moduly pro připojení kolon pro HS spojení

Komponenty použité v nastavení připojení dvou kolon

• 1/16” spojky (č. dílu: 225-19056)– Model: GVF16(2)-004, 10 ks v balení– Konstrukce s dvěma otvory
• 1/16” samčí/samičí konektor (č. dílu: 225-19057)– Množství: 1 kus
• Sada SMI Union (P/N: 227-35024-02) – pro hadičky s vnitřním průměrem 0,4 mm – 0,5 mm
• Restrictor tubing (P/N: 227-35023-02) – celková délka 2 m; rozřezaná na dvě části po 100 mm

Podmínky analýzy

• GC: Brevis GC-2050 
• HS: HS-20 NX 

HS-20 NX

• Teplota pece: 65 °C (20 min) 
• Teplota sample line: 90 °C 
• Teplota transfer line: 100 °C 
• Úroveň třepání: 3 
• Doba natlakování: 0,5 min 
• Doba vyrovnání tlaku: 0,1 min 
• Doba plnění: 0,5 min 
• Doba vyrovnání plnění: 0,1 min 
• Doba nástřiku: 0,5 min
• Doba proplachování jehly: 3 min 
• Doba GC analýzy: 9,1 min 
• Tlak plynu: 100 kPa, N2 
• Objem vzorku: 0,5 ml 

GC-2050

• Nosný plyn: N2 
• Režim řízení průtoku: Lineární konstantní rychlost (30 cm/s) 
• Průtok proplachování: 2 ml/min 
• Splitovací poměr: 20 
• Kolony: 
  • SH-BAC PLUS1 (P/N: 227-36260-01) (30 m × 0,32 mm I.D., 1,8 µm) 
  • SH-BAC PLUS2 (P/N: 227-36263-01) (30 m × 0,32 mm I.D., 0,6 µm) 
• Teplota kolony: 50 °C (8,5 min) 
• Teplota FID: 250 °C 
• Průtok H₂ FID: 32 ml/min 
• Průtok doplňovacího plynu FID: 24 ml/min, N₂ 
• Průtok vzduchu FID: 200 ml/min

Příprava vzorků

Kalibrační roztoky ethanolu byly připraveny v koncentracích 0,1; 0,5; 1,0 a 2,0 mg/mL. Jako vnitřní standard byl použit terc-butanol (1,0 mg/mL).
Do headspace vialky (20 mL) bylo přidáno 480 µL vody nebo krve, 20 µL kalibračního roztoku a 100 µL vnitřního standardu. Vialka byla uzavřena a promíchána. Pro experiment byla použita komerčně dostupná lidská plná krev.

Postup analýzy

Doporučený postup pro analýzu krevních vzorků je znázorněn na obr. 4. Nejprve byly analyzovány vzorky s vysokou koncentrací pro zlepšení reprodukovatelnosti signálu. Polární sloučeniny, jako ethanol a methanol, se snadno adsorbují na transfer line, což může způsobit kolísání plochy píků v počátečních analýzách. Proto je vhodné začít analýzou vysokých koncentrací, která zabrání fluktuacím signálu.

Shimadzu: Obr. 4 Doporučený analytický proces

Jako vzorek s vysokou koncentrací byl použit smíšený roztok obsahující 10 mg/ml ethanolu a terc-butanolu. Po jeho analýze byly analyzovány 2 sériové nástřiky vody jako slepé vzorky. Výsledné chromatogramy prokázaly, že v analýze slepých vzorků nebyly žádné stopy ethanolu nebo terc-butanolu.

Po tomto procesu předběžné úpravy bylo analyzováno 5 kalibračních roztoků, následovaných vzorky krve. Pro stanovení změny plochy píku v čase byl pro každou z 5 analýz vzorků krve analyzován vodný ethanolový standard s konečnou koncentrací 1 mg/ml.

Linearita kalibrační křivky

Ředěním vodných a krevních roztoků byly vytvořeny kalibrační křivky. Výsledky porovnané s kalibrační křivkou jsou uvedeny na obr. 5. Koeficient determinace (R²) přesáhl 0,999 pro obě matrice, což dokládá vynikající linearitu.

Shimadzu: Obr. 5 Kalibrační křivka standardního roztoku ethanolu (nahoře: SH-BAC PLUS1, dole: SH-BAC PLUS2)

Přesnost a opakovanost analýzy obohacených vzorků krve

Pro prokázání kvantitativní přesnosti analýzy vzorků krve byly vzorky krve připravené na předem stanovené koncentrace kvantifikovány pomocí kalibračních křivek vytvořených z roztoků krve a vody a byla stanovena opakovatelnost poměru ploch jednotlivých koncentrací (%RSD). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 níže. Každá koncentrace byla postupně analyzována 5krát doporučeným analytickým postupem (obr. 4). Pro stanovení změny plochy píku v čase byl analyzován 1 mg/ml standardního vodného roztoku pro každou z 5 analýz krevních vzorků. Opakovatelnost plochy píku 1 mg/ml standardního vodného roztoku byla shledána dobrou při %RSD=1,51.

Shimadzu: Tabulka 1 Opakovatelnost koncentrace a plochy píku %RSD (n=5)

Separace 10 těkavých látek (VOC) v krvi

Bylo analyzováno 10 VOC přidaných do krve (0,1 mg/mL): methanol, acetaldehyd, ethanol, isopropanol, acetonitril, aceton, terc-butanol, 1-propanol, methyl-ethyl-keton a ethyl-acetát. Výsledný chromatogram je uveden na obr. 6. Všechny píky byly detekovány do 6,0 min na koloně BAC PLUS1 a do 3,5 min na koloně BAC PLUS2 s dobrým rozlišením. Pořadí eluovaných sloučenin se mezi kolonami významně lišilo, což zvyšuje kvalitativní spolehlivost systému. Tabulka 2 ukazuje retenční čas každé sloučeniny a opakovatelnost (n=5) poměru plochy píku pro interní standard terc-butanolu.

Shimadzu: Obr. 6 Chromatogramy smíšeného roztoku obsahujícího 10 VOC v krvi (nahoře - SH-BAC PLUS1, dole - SH-BAC PLUS2).

Shimadzu: Tabulka 2 Opakovatelnost retenčního času a plochy píku %RSD (n=5).

Závěr

Experiment ukázal možnost analýzy obsahu alkoholu v krvi s využitím dvou kolon na kompaktním systému Brevis GC-2050 s headspace jednotkou HS-20 NX. Konfigurace se dvěma kolonami umožňuje křížovou kontrolu v jedné analýze. Kromě toho byl jako nosný plyn použit dusík namísto helia. Vodík sice umožňuje vysokorychlostní analýzu, ale vyžaduje také opatrnou manipulaci, takže z hlediska bezpečnosti se doporučuje instalace různých volitelných nástrojů, jako je senzor vodíku a uzavírací ventil. Dusík je relativně levný a snadno se s ním manipuluje a tento experiment prokázal, že poskytuje spolehlivé výsledky při zachování dobré separace.