Pochopení efektu „Solvent Focusing“ v plynové chromatografii a jeho optimalizace pro splitless nástřiky

Z pohledu základního principu plynové chromatografie (GC) lze analyzovat vzorky v kapalné, pevné nebo plynné fázi. Vzorky, které nejsou původně v plynném stavu, jsou v nástřikovém prostoru odpařeny – vzniklá plynná fáze obsahuje rozpouštědlo a analyt, které jsou následně separovány na chromatografické koloně. Typ stacionární fáze v koloně určuje způsob separace jednotlivých složek směsi, zatímco úlohou mobilní fáze – obvykle inertního plynu – je přenášet analyty kolonou bez chemické interakce.¹

Při splitless nástřiku je téměř celý objem vzorku převeden na kolonu. Tento režim je ideální pro stanovení stopových koncentrací, ale zároveň zvyšuje riziko ovlivnění separace rozpouštědlem, protože do kolony se zavádí i velký objem rozpouštědla. Proto je nezbytné pochopit všechny proměnné, které ovlivňují nástřik, a optimalizovat je – zejména roli rozpouštědla a tzv. solvent focusing efektu.

Solvent focusing, tvar píku a stacionární fáze

Po odpaření vzorku vstupují páry vzorku na začátek kolony. Pokud je teplota pece dostatečně nízká, dochází ke kondenzaci par zpět na kapalnou fázi. Míra této rekondenzace závisí na rozdílu teplot mezi injektorem a pecí GC (obrázek 1).² Na začátku kolony se vytváří tenký film kapaliny – tzv. flooded zone. Tato zóna zadržuje analyty a brání jim v pohybu kolonou – vzniká tzv. retention hill (retenční kopec) - obr. 2. Pokud je tato oblast optimálně zakoncentrována, říkáme, že došlo k „optimálnímu zaostření“. Obecně platí, že čím větší rekondenzace, tím ostřejší píky analytů.

Agilent: Obrázek 1. Demonstrace zakoncentrování vzorku na koloně jako funkce teplotního rozdílu mezi vstupní teplotou a teplotou pece.

Agilent: Obrázek 2. Příklad toho, jak se vzorek zakoncentruje na začátku kolony a rozprostírá se, aby vytvořil tenký film.

Jakmile se rozpouštědlo začne odpařovat, odpařuje se nejprve vrstva nejblíže horkému injektoru, zatímco vzdálenější vrstvy se znovu nahrazují parami rozpouštědla. Po odpaření zůstává analyt kondenzovaný na začátku kolony, jak je vidět na obrázku 3. Rychlost odpařování závisí na těkavosti rozpouštědla a jeho objemu. Pokud mají analyty podobnou těkavost jako rozpouštědlo nebo k němu mají vysokou afinitu, může docházet k deformaci píků.

Agilent: Obrázek 3. Ukázka, jak se rozpouštědlo odpařuje a zanechává analyty na začátku chromatografické kolony.

Interakce mezi rozpouštědlem a stacionární fází

Při nesouladu polarity rozpouštědla a stacionární fáze dochází k neoptimálnímu smáčení kolony. Pokud je rozpouštědlo výrazně polárnější než fáze, vzniká efekt podobný vodě na navoskovaném povrchu – kapalina se „shlukuje“ a nerovnoměrně rozprostírá po koloně³ (obrázek 4). Tím se zvyšuje velikost "flooded zóny" a zmenšuje retenční kopec, což umožňuje únik části analytů z rozpouštědla, což vede ke štěpení píků a jejich rozšiřování.² Tento jev se nazývá reverzní efekt rozpouštědla (reverse solvent effect).

Agilent: Obrázek 4. Příklad toho, jak se zvětšuje flooded zóna a jak může být odpařování rozpouštědla ovlivněno nesouladem polarity rozpouštědla a polarity stacionární fáze kolony

Pokud má analyt vyšší afinitu k rozpouštědlu než ke stacionární fázi, může být částečně vázán v rozpouštědle, což snižuje jeho retenci a odezvu. Tento efekt lze částečně omezit prodloužením kolony (např. z 30 m na 60 m), avšak u krátkých kolon (např. 20 m) má volba rozpouštědla výraznější vliv na citlivost metody.

Obecné pravidlo pro volbu rozpouštědla je shodná polarita s fází kolony, jak je uvedeno v Tabulce 1. Například pro nepolární kolonu Agilent J&W DB-5 je vhodné použít nepolární rozpouštědlo, jako je hexan. Středně polární rozpouštědla, např. dichlormethan (DCM), mohou být ještě přijatelná, avšak použití vysoce polárních rozpouštědel, jako aceton nebo acetonitril, se nedoporučuje.

Agilent: Tabulka 1. Index polarity různých rozpouštědel používaných v plynové chromatografii a obecná kompatibilita s fázemi kolon

Retenční gap a ochranná kolona

Použití nepotažené (deaktivované) kapiláry před analytickou kolonou, označované jako retenční gap (retention gap) nebo také ochranná kolona (guard column), pomáhá k opětovnému zaostření analyzovaných látek a zlepšení tvaru píků.

Retenční gap slouží jako prodloužení lineru injektoru a zajišťuje lepší zaostření analytů na začátku kolony. Průměr této kapiláry by měl být stejný nebo větší než analytická kolona. Ochranná kolona má spíše funkci filtru – chrání analytickou kolonu před matricí a kontaminací.

Když je vzorek aplikován na neaktivní kapiláru, rozpouštědlo a analyt vytvoří flooded zónu, která se rychleji pohybuje touto částí kolony a znovu se kondenzuje až na začátku analytické kolony. Ale protože ochranná kolona neobsahuje žádnou fázi, bude mít nízký retenční faktor, což umožní rozpouštědlu a rozpuštěným látkám pohybovat se rychleji přes ochrannou kolonu, a budou zpomaleny a znovu kondenzovány při interakci s fází analytické kolony, jak je znázorněno na obrázku 5. 

Ägilent: Obrázek 5. Příklad toho, jak se rozpouštědla a pásmo rozpuštěné látky znovu zaostřují pomocí retenčního gapu

To poskytne rozpouštědlu druhou šanci vytvořit jasný retenční kopec a může znovu koncentrovat pás rozpuštěné látky faktorem 100, čímž se zmenší velikost pásu rozpuštěné látky a zlepší se tvar píku, jak je znázorněno na obrázku 6.^4,5.Tento proces umožňuje znovuzaostření (refocusing), čímž se výrazně zlepšuje tvar píků a zvyšuje citlivost.

Agilent: Obrázek 6. (A) Standard analyzovaný na Agilent J&W DB-1 (15 m × 0,25 mm, 0,25 µm) bez retenčního gapu. (B) S přidáním retenčního gapu 1 m × 0,32 mm. Identifikace píku: (1) 1,3-DCP; (2) 3-hexanol; (3) butylacetát; (4) 1-heptanol; (5) 3-oktanon; (6) 1,2-dichlorbenzen.

Solvent focusing a „cold trapping“

Dalším důležitým parametrem je vztah mezi počáteční teplotou pece a teplotou varu rozpouštědla. Kondenzace a rekondenzace rozpouštědla závisí na těchto teplotách – pokud teplota pece nepřekročí bod varu rozpouštědla, nedochází k jeho úplnému odpaření, což vede k „cold trappingu“ (zachycení analytů v chladné části kolony).

Např. dichlormethan (T_var = 39,6 °C) je ideální, protože se při běžném startu programu (40 °C) odpaří rychle. Naproti tomu acetonitril (T_var = 82 °C) se začne odpařovat později, což způsobí větší flooded zónu a deformaci píků, jak lze vidět na obrázku 6A u rozpuštěných látek 1, 2, a 3.

Příprava vzorku a volba rozpouštědla

Před zavedením účinných metod přípravy vzorků pro analýzu pesticidů se k ochraně analytické kolony před matricí nebo netěkavými analytickými látkami používala ochranná kolona. Primární metodou přípravy vzorků bylo ředění rozpouštědlem v hexanu nebo dichlormethanu, které potenciálně prošlo filtrem, a poté bylo vstříknuto přímo do vstupu a analyzováno na koloně typu 5% fenylová fáze. Tuto metodu lze označit jako metodu „dilute and shoot“ (zředit a nastříknout). Jelikož dichlormethan a hexan jsou oba kompatibilní rozpouštědla s 5% fenylovou fází, ochranná kolona byla potřebná pouze k ochraně analytické kolony před matricí, nikoli před nepříznivou smáčivostí.

S přijetím složitějších technik přípravy vzorků, tradičně používaných v kapalinové chromatografii, se vzorky obvykle připravují v polárním rozpouštědle acetonitrilu. Pro GC analýzu se používá výměna rozpouštědla, což je proces vysušení vzorku v jednom rozpouštědle pod proudem dusíku a jeho rekonstituce v jiném rozpouštědle, jako je hexan. Tento postup se provádí, aby se zajistila správná interakce mezi rozpouštědlem a fází kolony. Vzhledem k tomu, že tyto vyčištěné vzorky obsahovaly méně matrice, snížila se potřeba ochranné kolony.⁶ Postupně se snížila potřeba výměny rozpouštědel, aby se zkrátila celková doba přípravy vzorků, ale tím zůstaly připravené vzorky v konečném rozpouštědle acetonitrilu.

Jelikož acetonitril je polárnější rozpouštědlo a analýza pesticidů se provádí na nepolární 5% fenylové koloniální fázi, vzniká zde potenciál pro nesprávnou smáčivost a vliv na tvar píku, což způsobuje snížení odezvy, jak je vidět na obrázku 7.

Agilent: Obrázek 7. Příklad vzorku pesticidů připraveného s koncentrací 20 ppb a analyzovaného na koloně Agilent J&W DB-5ms UI - připraveno v dichlormethanu (DCM) a acetonitrilu pomocí analytické metody popsané v publikaci Agilent 5994-0916EN.

Tepelná stabilita a solvent focusing

Na velikost flooded zóny má vliv i tloušťka filmu stacionární fáze. Silnější film zvyšuje kapacitu kolony, zmenšuje flooded zónu a zlepšuje tvar píků. Nicméně může vést i k většímu krvácení kolony. Tabulka 2 uvádí příklady rozsahu kapacity kolony na základě tloušťky filmu. Zatímco kolony s tlustším filmem mohou nabídnout zvýšení kapacity, zvětšení stacionární fáze kolony také poskytne větší potenciál pro přítomnost krvácení kolony.

Agilent: Tabulka 2. Kapacita kolony u různých tloušťek filmu stacionární fáze kolony

Krvácení stacionární fáze vzniká při vysokých teplotách, kdy polymerní fáze degraduje a vznikají těkavé kruhové struktury, které zvyšují šum a posunují základní linii - viz obrázek 9. Tento jev negativně ovlivňuje detekci stopových látek, zejména při použití hmotnostního detektoru (MS). Proto se pro GC/MS aplikace běžně používají kolony s filmem ≤ 0,25 µm.⁷

Agilent: Obrázek 9. Vzorek pesticidů o koncentraci 20 ppb analyzovaný na koloně Agilent J&W DB-5Q. Připraveno v dichlormethanu (DCM) a acetonitrilu pomocí analytické metody bez ochranné kolony, jak je popsáno v publikaci Agilent 5994-0916EN.

Deaktivace křemenného povrchu

Faktor při určování tepelné stability GC kolony je také částečně způsoben procesem deaktivace taveného křemene a přirozenou přítomností silanolů na povrchu taveného křemene. V závislosti na způsobu výroby taveného křemene mohou existovat rozdíly v koncentraci přítomných silanolů, plně hydratovaného křemene, a mohou se pohybovat od 6 do 10 silanolů na čtvereční nanometr na povrchu kapiláry. Jak analytické látky a rozpouštědlo difundují do a z analytické kolony, interagují také s volnými silanoly. Tato interakce může vést k aktivitě, která může ovlivnit tvar píku, proto je důležité provést deaktivaci, aby se co nejvíce snížil obsah silanolů, což je proces, který lze provést různými způsoby.⁸

Agilent: Obrázek 8. Mechanismus zpětného štípání stacionární fáze kolony a uvolňování cyklických struktur způsobujících zvýšení signálu pozadí, které je také známé jako krvácení kolony

Polární rozpouštědla mají větší afinitu k silanolům a když se rozpouštědlo rekondenzuje na začátku kolony, interakce mezi rozpouštědlem a silanoly může způsobit zmenšení flooded zóny. Naopak, v závislosti na chemickém složení povrchu taveného křemene, když je přítomno méně volných silanolů, mohou mít některá rozpouštědla menší afinitu (dokonce odpudivost) k chemickému složení povrchové fáze kolony, což způsobí zvětšení flooded zóny.

Díky nedávným pokrokům v technologiích deaktivace je možné vytvořit deaktivaci, která dále snižuje obsah silanolů na povrchu taveného křemene, čímž vznikají ultra tepelně stabilní a ultra inertní kolony. Ale jak se jejich obsah silanolu dále snižuje, nesoulad polarity rozpouštědla s fází kolony může vést ke zvětšení flooded zóny. Použití ochranné kolony umožňuje přeostření rozpouštědla a analytů a koriguje účinky způsobené nesouladem rozpouštědla a interakcemi fází kolony.

Například GC kolony řady Agilent J&W 5Q procházejí odlišným procesem deaktivace taveného křemene a čištěním polymerní fáze, což z nich činí tepelně nejstabilnější GC kolony.⁷ Díky tomuto procesu deaktivace dochází k významnému snížení obsahu silanolů na povrchu polymeru a taveného křemene, čímž vzniká ultra tepelně stabilní analytická kolona. U těchto kolon s tak nízkým obsahem volných silanolů může nesprávné sladění rozpouštědla s fází vést ke zvětšení flooded zóny a způsobit zkreslení píku, jak je znázorněno na obrázku 9. 

Standardní směs pesticidů byla připravena samostatně ve dvou rozpouštědlech s různou polaritou, dichlormethanu a acetonitrilu. Tento standard byl připraven o koncentraci 20 ppb a analyzován na GC systému Agilent 8890 spojeném s trojitým kvadrupólem GC/MS Agilent 7010D v dynamickém režimu vícenásobné reakce (dMRM). Dramatický pokles výšky píku a zkreslení píků při přípravě v acetonitrilu je způsoben interakcí polárního rozpouštědla s nepolární fází/povrchem kolony, což vede ke zvětšení flooded zóny a rozostření pásma rozpuštěné látky. K opětovnému zaostření rozpouštědla a analytů na analytickou kolonu bylo v tomto případě účinným řešením použití retenčního gapu. Přidáním jednoho metru nepotaženého a deaktivovaného taveného křemene před analytickou kolonou bylo možné znovu zaostřit analyty a zlepšit tvar píku, jak je znázorněno na obrázku 10.

Agilent: Obrázek 10. Vzorek pesticidů o koncentraci 20 ppb analyzovaný na koloně Agilent J&W DB‑5Q. Připraveno v dichlormethanu (DCM) a acetonitrilu pomocí analytické metody popsané v publikaci Agilent 5994-0916EN s 1metrovou ochrannou kolonou se stejným vnitřním průměrem jako analytická kolona.

Závěr

Úspěšná plynová chromatografie závisí na celé řadě faktorů: rychlosti nástřiku, volbě rozpouštědla, instalaci a výběru kolony. Volba rozpouštědla je zásadní nejen pro rozpuštění analytu, ale i pro správnou rekondenzaci na začátku kolony.

U splitless nástřiků, kde se na kolonu dostává velké množství rozpouštědla, může nesoulad polarity mezi rozpouštědlem a fází způsobit rozšíření flooded zóny a deformaci píků. Tento problém lze účinně vyřešit použitím ochranné kolony nebo retenčního gapu, které pomohou znovu zaostřit analyty a zlepšit kvalitu chromatografických píků.