VITATOX 2020 - den 3
http://www.radanal.cz/cs/odborne-akce/
VITATOX je vědecká konference zaměřená na vývoj v oboru analytické chemie a představení diskutovaných témat jako Vitaminy, Antioxidanty, Terapeutické monitorování léčiv, Drogy, Alkohol a Toxicita látek kolem nás v „době jedové“.
Přehled přednášek, abstraktů z třetího dne konference
1. SIMULTANEOUS DETERMINATION OF VITAMINS B1, B2, B6 IN WHOLE BLOOD BY LC MS/MS (Martin Knirsch, RECIPE Chemicals + Instruments GmbH)
Water-soluble vitamins B1 (thiamine diphosphate), B2 (Flavin adenine dinucleotide), B6 (pyridoxal and pyridoxale phosphate) are involved in cell energy metabolism. They are chemically and functionally very diverse.
Possible causes of Vitamin B Deficiency are: Malnutrition, Diabetes and other metabolic diseases, alcoholism, hemodialysis. The clinical manifestations are: Alterations of the skin, neurological diseases and various forms of anemia.
Accurate diagnosis and monitoring of the treatment requires quantification of the critical
B vitamins.
RECIPE has developed a simple, one-step assay for the simultaneous determination of Vitamin B1, B2 and B6 from only 50 µL of whole blood by LC MS/MS. For accurate and precise quantitation, the kit includes a multi-level whole-blood calibrator. Matrix effects are compensated using stable isotope labeled internal standards.
RECIPE’s fully validated and CE IVD certified ClinMass® Kit enables the fast, easy and reliable de-termination of 3 B-Vitamins in one run.
2. STANOVENÍ ALANTOINU, UKAZATELE OXIDAČNÍHO STRESU, POMOCÍ LC/TMS (Mgr. Michal Kopčil, UNIVERZITA PARDUBICE, FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ, KATEDRA BIOLOGICKÝCH A BIOCHEMICKÝCH VĚD)
Klinické údaje o úloze reaktivních forem kyslíku v patologických procesech naznačují, že standardní terapie v kombinaci s antioxidační léčbou může mít příznivé účinky na zdraví člověka. Z tohoto důvodu je nutná kvantifikace oxidačního stresu, která je v laboratorní diagnostice založena převážně na stanovení hladin ukazatelů oxidačního stresu a monitorování hladin antioxidantů. Jedním z ukazatelů oxidačního stresu je alantoin, produkt reakce reaktivních forem kyslíku s kyselinou močovou v lidském organismu. V dnešní době jsou obecně na klinické laboratorní testy kladeny vysoké nároky, zejména na co nejjednodušší odběr vzorku, jeho snadný transport do laboratoře a co nejkratší dobu analýzy. Tyto požadavky splňuje technika suché kapky při odběru biologického materiálu, následovaná analýzou biologicky významných látek kapalinovou chromatografií s hmotnostní detekcí.
Byla vyvinuta rychlá, jednoduchá a selektivní HPLC-MS/MS metoda pro stanovení alantoinu a kyseliny močové v krvi, odebrané technikou suché kapky, s použitím isotopově značených vnitřních standardů. Separace probíhala na reverzní fázi během tří minut. Analytické parametry metody (linearita, přesnost a správnost) byly vyhovující. Prezentovanou metodou byly ve vzorcích suché kapky krve dobrovolných dárců stanoveny hladiny alantoinu a kyseliny močové, které jsou porovnatelné s literaturou. Metoda je vhodná pro monitorování hladin alantoinu a kyseliny močové v klinické praxi.
3. IDENTIFIKACE BIOAKTIVNÍCH METABOLITŮ V ROSTLINNÝCH EXTRAKTECH POMOCÍ KORELAČNÍ METABOLOMIKY (Mgr. Jiří Grúz, Ph.D., Laboratoř růstových regulátorů, Ústav experimentální botaniky Akademie věd České republiky & Univerzita Palackého)
Vyhledávání biologicky aktivních látek v komplexních směsích jako jsou rostlinné extrakty je zásadním úkolem při studiu rostlinné fyziologie. Identifikace aktivní látky ve směsi je také základním úkolem farmakognosie. Klasické postupy vycházející z frakcionace řízené biologickou aktivitou jsou velmi zdlouhavé, nákladné a hlavně často neúspěšné.
Metabolomiku lze s výhodou použít pro dereplikaci, čímž se myslí identiifkace všech známých látek ve směsi, aby se předešlo opakování (replikaci) experimentu. Metabolomiku lze ovšem využít mnohem efektivněji v kombinaci se stanovením bioologické aktivity.
Nový postup využívá rychlou paralelní frakcionaci a následnou metabolomickou analýzu všech frakcí. Korelace bilogické aktivity s plochami všech features poskytne list kandidátů, tedy potenciálně aktivních látek. Seznam techto kandidátů lze dále zúžit pomocí bioinformatických a chemoinformatických postupů, v ideálním případě až na jedinou látku. Ve srovnání s klasickou frakcionací řízenou biologickou aktivitou je takový postup mnohonásobně rychlejší.
4. SULFATOVANÉ FENOLICKÉ KYSELINY V ROSTLINÁCH A DALŠÍCH ORGANISMECH (Mgr. Klára Supíková, Laboratoř růstových regulátorů, Ústav experimentální botaniky Akademie věd České republiky & Univerzita Palackého)
Sulfatované látky jsou převážně považované za metabolity mořských organismů. Hlavní zástupce kyselina zosterová byla poprvé objeva v mořských travách rodu Zostera (Todd et al., 1993), které dokáží jako jediné z rostlin růst ve slané vodě (den Hartog & Kuo, 2006). Později byly objeveny kyseliny 4-(sulfooxy)benzoová a 4-(sulfooxy)fenyloctová v mořských řasách rodu Dasycladus (Kurth et al., 2015).
Kyseliny zosterová a 4-(sulfooxy)benzoová byly nedávno detekované i v suchozemské rostlině a kulturní plodině ovsu setém (Supíková, 2018). Sulfatované metabolity jsou relativně neprozkoumané, o jejich funkci v rostlinách je toho známo jen málo. Sulfatace by se podle některých předpokladů mohla uplatňovat při inaktivaci fenolických kyselin a pro jejich skladování (Kurth et al., 2015; Thoms & Schupp, 2008).
Z praktického hlediska může být zajímavá kyselina zosterová, která má anti-biofilmovou aktivitu, a lze ji např. použít při ošetřování povrchu lodí proti mořským mikroorganismům a drobným korýšům ulpívajícím na povrchu (Catto et al., 2015; Achamlale et al., 2009).
Objev sulfatovaných fenolických kyselin v ovsu přinesl otázku, zda jsou sulfatované látky přítomné i v jiných suchozemských rostlinách, nebo zda organismy produkují i jiné sulfatované sekundární metabolity. V této práci byla k detekci sulfatovaných látek využitá UHPLC-TOF-MS metoda, která umožňuje detekci typické neutrální ztráty Δm/z 79.957 Da, což je monoizotopická hmotnost oxidu sírového uvolněného při fragmentaci z prekurzorového molekulárního iontu (Kurth et al., 2015).
Tímto způsobem se podařilo získat nové informace o výskytu kyselin zosterové, 4-(sulfooxy)fenyloctové a 4-(sulfooxy)benzoové v řadě rostlin, hub a plísní. Dále se podařilo identifikovat několik dosud neznámých sulfatovaných látek, jejichž význam a fyziologická funkce jsou předmětem dalšího výzkumu.
5. ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITA U VYBRANÝCH ODRŮD DROBNÉHO OVOCE (Ing. Radek Vávra, Ph.D., VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY)
Drobné bobulovité ovoce obsahuje velké množství antioxidantů (anthokyany, vitamin C). Tyto látky chrání buňky před poškozením volnými radikály. Pro stanovení látek s antioxidační aktivitou ve vybraných odrůdách rybízů a angreštů byly vybrány metody Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) a průtoková injekční analýza (FIA) ve spojení s multikanálovým elektrochemickým detektorem CoulArray (FIA/ECD). Tyto metody jsou vhodné pro hodnocení celkového obsahu bioaktivních látek s antioxidačními vlastnostmi. Nicméně u černého rybízu není možné použít standardní techniku UV-VIS vzhledem k tomu, že anthokyany výrazně ruší spektrofotometrické stanovení. Proto byla tato studie doplněna o detekci vybraných anthokyanů. Vitamin C se vyskytuje především v potravinách rostlinného původu, nejvíce ho obsahuje čerstvá zelenina a ovoce. Černý rybíz je významným zdrojem vitaminu C, jehož průměrný obsah je 166 mg/100 g ovoce.
6. MATERIÁL Z HRUŠNÍ JAKO VÝZNAMNÝ ZDROJ FENOLICKÝCH LÁTEK (doc. RNDr. Dalibor Šatinský, Ph.D., Katedra analytické chemie, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova)
Předmětem projektu je pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) sledovat obsah a zastoupení fenolických látek v biomase hrušní (listí, kůra, pupeny, květy, plody štěpka) u různých odrůd a monitorovat měnící se fenolický profil v rámci vegetačního období. Výzkum poukazuje na možnost znovuvyužití hojně se vyskytujícího zemědělského materiálu s uplatněním v kosmetickém či potravinářském průmyslu.
Cílem výzkumu byla optimalizace a validace chromatografické metody pro separaci arbutinu, kyseliny chlorogenové a jejich derivátů, rutinu. Biomasa byla extrahována 0,1% kyselinou mravenčí (2% kyselina octová u plodů) pomocí ultrazvuku. HPLC analýza probíhala na koloně ASCENTIS Express RP-Amide 150×4.6 mm, 2.7 μm. Byla využita gradientová eluce s mobilní fázi tvořenou organickou složkou acetonitrilem (ACN) a vodnou složkou s 0,85% kyselinou fosforečnou (pH = 2,2). K detekci byl využit DAD detektor při vlnových délkách 220 nm, 327 nm a 354 nm. Teplota kolonového prostoru byla 30 °C, nástřik byl 1 μl (u plodů 5 μl) a průtoková rychlost mobilní fáze 1 ml/min.
Metoda byla validována před kvantifikaci fenolů v extraktech listí s následujícími validačními parametry: linearita (R² = 0,997 – 0,999), opakovatelnost (RSD= 0,49 – 3,09 %), výtěžnost (96,2 – 131,61 %) a přesnost (RSD= 0,77 – 2,87 %).
Majoritní fenolickou složku tvořil arbutin s kyselinou chlorogenovou. Množství fenolů v rostlinném materiálu hrušně bylo mnohonásobně vyšší než v plodech a nejvíc fenolických látek bylo zjištěno v období jara.
7. SEX, VÍNO A ANTIOXIDANTY (doc. Ing. Aleš Horna, CSc., RADANAL)
Antioxidanty patří mezi tzv. sekundární metabolity rostlin, které jejich syntézou reagují na podmínky okolního prostředí (např. podnebí, typ půdy, počasí, ochrana před škůdci) nebo je užívají k regulaci metabolických a fyziologických pochodů. Konzumace těchto látek dále přináší mnoho zdravotních benefitů pro živočichy. Díky schopnosti eliminovat volné radikály vznikající např. při biochemických reakcích v organelách, napomáhají udržovat rovnováhu mezi oxidačními a antioxidačními mechanismy organismu a předcházet tak indukci oxidačního stresu. Není proto divu, že obsah antioxidantů v různých potravinách a nápojích se v současné době dostává do popředí zájmu odborníků i široké veřejnosti. K jeho stanovení je užívána celá řada analytických metod, mezi něž lze zařadit metody hodnotící eliminaci syntetických radikálů (např. TEAC, DPPH), eliminaci kyslíkových radikálů (např. ORAC) či eliminaci lipidové peroxidace, dále pak metody hodnotící redoxní vlastnosti látek založené na chemické nebo elektrochemické detekci (např. cyklická voltametrie, HPLC-ECD). Obecně je známo, že vysoké množství antioxidantů se vyskytuje v ovoci, zelenině, čaji a produktech z nich vyrobených. Jako příklad může být uvedeno červené víno, jehož blahodárné účinky na kardiovaskulární systém jsou připisovány antioxidantu ze skupiny polyfenolů, resveratrolu.
Aktuálním tématem se stává i možné využití velkého množství antioxidantů vyskytujících se v bioodpadu (např. listí, kůra). Diskutovanou otázkou je v tomto ohledu i obsah antioxidantů v moči, což nahrává příznivcům urinoterapie. Ta je v některých oblastech (např. Indie) praktikována již tisíce let a je úzce spjata s náboženskými rituály. Díky tomu, že je moč při odchodu z organismu v kontaktu s pohlavními orgány, vznikla domněnka, že její pití dodává tělu sexuální energii.