Řešení nízké výtěžnosti při SPE: Jak identifikovat a odstranit příčiny ztrát analytu

Nízká výtěžnost analytu patří mezi nejčastější problémy při přípravě vzorků metodou extrakce na pevné fázi (Solid Phase Extraction, SPE). V tomto dílu série Phenomenex Video Tip vysvětluje Genevie Hodson, Senior Manager Technical Support and Applications ve společnosti Phenomenex, praktický postup při řešení situací, kdy je výtěžnost SPE metody nižší, než se očekává.

Základním cílem není pouze potvrdit, že je výtěžnost nízká, ale především zjistit, ve kterém kroku SPE postupu dochází ke ztrátě analytu. Teprve poté lze zvolit vhodná nápravná opatření.

Základní princip řešení nízké výtěžnosti při SPE

Zjistěte, kam analyt zmizel

Nejdůležitějším krokem při řešení nízké výtěžnosti je určit, kde se ztracený analyt nachází.

Na začátku předpokládáme, že vzorek obsahoval 100 % cílového analytu. Pokud je po SPE výtěžnost nižší, část analytu byla během extrakce ztracena.

Pro nalezení místa ztráty je nutné samostatně zachytit a analyzovat všechny frakce vznikající během SPE postupu.

Frakce určené ke sběru

Během SPE postupu se samostatně zachycují následující frakce:

• Nanášková frakce (load fraction) – frakce získaná během nanášení vzorku na SPE sorbent
• Promývací frakce (wash fraction) – frakce získaná během promývacího kroku
• Eluční frakce (elute fraction) – frakce obsahující látky eluované ze sorbentu

Každá frakce se zachytí do vialky a následně analyzuje pomocí běžné analytické metody.

Výsledky ukážou, zda se analyt nachází:

• V nanáškové frakci
• V některé z promývacích frakcí
• V eluční frakci
• Nebo není přítomen v žádné z analyzovaných frakcí

Poloha analytu poskytuje přímou informaci o příčině problému a určuje další kroky optimalizace.

Situace 1: Analyt se nachází v nanáškové frakci

Co to znamená

• Pokud je analyt detekován v nanáškové frakci, nebyl při nanesení vzorku zachycen SPE sorbentem.
• Místo navázání na stacionární fázi prošel přímo skrz SPE kolonku.

Možné příčiny

1. Nevhodně zvolený SPE sorbent

• Použitý sorbent nemusí být vhodný pro daný analyt.
• Pokud mezi analytem a sorbentem nevznikají dostatečné interakce, nedojde k jeho retenci.

2. Příliš silné rozpouštědlo vzorku

• Vzorek může být připraven v příliš silném rozpouštědle.
• Takové rozpouštědlo omezuje interakci analytu se sorbentem a způsobuje jeho průnik kolonkou během nanášení.

3. Nesprávné pH

• Retence analytu často závisí na jeho inozaci.
• Pokud není pH nastaveno správně, analyt nebude se sorbentem interagovat požadovaným způsobem a nedojde k jeho retenci.

4. Přesycení sorbentu

• Na SPE kolonku mohlo být naneseno:
  • Příliš velké množství analytu
  • Příliš velké množství matrice
• Po překročení kapacity sorbentu dochází k průniku analytu do nanáškové frakce.

Doporučené řešení

Pokud je příčinou přesycení, lze použít větší množství sorbentu, které zajistí dostatečnou retenční kapacitu.

Situace 2: Analyt se nachází v promývací frakci

Co to znamená

Pokud je analyt nalezen v promývací frakci, byl nejprve zachycen na sorbentu, ale následně se uvolnil během promývání.

Možné příčiny

1. Příliš silné promývací rozpouštědlo

• Nejčastější příčinou bývá příliš agresivní promývací krok.
• Promývací rozpouštědlo má příliš vysokou eluční sílu a analyt se uvolňuje dříve, než je požadováno.

2. Nesprávné pH během promývání

• Pokud je retence závislá na pH, musí být stejné podmínky zachovány po celou dobu SPE postupu.
• Změna pH během promývání může způsobit předčasnou eluci analytu.

Doporučené řešení

Je vhodné zkontrolovat:

• Složení promývacího rozpouštědla
• Jeho eluční sílu
• pH během promývacího kroku

Cílem je zajistit, aby analyt zůstal na sorbentu až do elučního kroku.

Situace 3: Analyt není nalezen v žádné frakci

Co to znamená

• Pokud analyt není detekován v nanáškové, promývací ani eluční frakci, je pravděpodobné, že zůstal navázán na SPE sorbentu.
• V takovém případě nedošlo k jeho úplné eluci.

Možná příčina

Nedostatečně silné eluční rozpouštědlo

• Eluční rozpouštědlo nemusí mít dostatečnou sílu k uvolnění analytu ze sorbentu.
• Analyt proto zůstává navázán na stacionární fázi a není zachycen ve sběrné vialce.

Doporučené řešení

• V závěrečném elučním kroku je třeba zvýšit sílu elučního rozpouštědla.
• Silnější rozpouštědlo umožní účinnější desorpci analytu a zlepší výtěžnost.

Souhrnný postup řešení nízké výtěžnosti

Doporučený pracovní postup zahrnuje čtyři kroky:

1. Zachycení všech SPE frakcí

Odeberte:

• Nanáškovou frakci
• Promývací frakce
• Eluční frakci

2. Samostatná analýza jednotlivých frakcí

Pomocí analytické metody určete, kde se analyt nachází.

3. Identifikace příčiny problému

Umístění analytu  /  Pravděpodobná příčina

• Nanášková frakce: Nevhodný sorbent, příliš silné rozpouštědlo vzorku, nesprávné pH, přesycení sorbentu
• Promývací frakce: Příliš silné promývání, nesprávné pH
• Nenalezen v žádné frakci: Nedostatečná eluce ze sorbentu

4. Zavedení nápravných opatření

Podle výsledků lze upravit:

• Typ SPE sorbentu
• Složení rozpouštědla vzorku
• pH podmínky
• Množství sorbentu
• Sílu promývacího rozpouštědla
• Sílu elučního rozpouštědla

Další časté problémy při SPE

Kromě nízké výtěžnosti se při SPE metodách často objevují také další komplikace.

• Kontaminace
• Problémy s reprodukovatelností
• Problémy s průtokem

Závěr

Úspěšné řešení nízké výtěžnosti při SPE vyžaduje systematické zjištění, ve kterém kroku extrakčního procesu dochází ke ztrátě analytu. Analýza jednotlivých SPE frakcí umožňuje přesně určit příčinu problému a následně zavést cílená nápravná opatření.

Ať už analyt prochází sorbentem během nanášení vzorku, uvolňuje se při promývání nebo zůstává pevně navázán na sorbentu po dokončení extrakce, správně provedená frakční analýza poskytuje jasný základ pro optimalizaci SPE metody a dosažení požadované výtěžnosti.