Utilizing the Pegasus GC-HRT 4D for Improved Yeast ® Metabolite Characterization

Význam tématu

Metabolomická charakterizace kvasinek je zásadní pro optimalizaci biotechnologických procesů, jako je výroba bioetanolu či organických kyselin, a umožňuje hloubkové porozumění buněčnému metabolismu jako základu systémové biologie a bioinženýrství.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl porovnat klasický GC-HRT a pokročilý GC×GC-HRT režim na přístroji Pegasus GC-HRT 4D pro profilování metabolitů z kvasinkových extraktů, se zaměřením na rozlišení, kvalitu spekter a přesnost identifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kvasinek (autolysát i sušené kvasinky) byly extrahovány směsí H2O/CH3OH/CHCl3, vysušeny a derivatizovány dvoustupňově methoximací a trimethylsilylací. Data se sbírala ve 1D a 2D režimu:

• Chromatograf: Agilent 7890 s autosamplerem Gerstel MPS2
• Kolony: Rxi-5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm) a Rxi-17SilMS (0,9 m × 0,25 mm × 0,25 μm)
• Hmotnostní spektrometr: LECO Pegasus HRT 4D (rozlišení R=25 000, rozsah m/z 35–510 pro EI, 60–1200 pro CI)
• Ionizace: elektronová (EI) a chemická (CI) s 5 % NH3 v CH4
• Software: ChromaTOF-HRT pro kalibraci, dekonvoluci (HRD) a vyhledávání v databázích NIST 2014 a Wiley 10

Hlavní výsledky a diskuse

Ve vzorcích kvasinkového autolysátu bylo identifikováno přes 38 reprezentativních metabolitů (kyseliny, aminokyseliny, cukry, nukleotidy). GC×GC-HRT poskytl výrazně vyšší kapacitu separace a čistší spektra než jednorozměrný GC-HRT. Průměrná hodnota podobnosti spekter vůči knihovnám dosáhla 911/1000 a průměrná odchylka hmotnostních měření byla pod 1 ppm. Ukázky dekonvoluce dokazují schopnost separovat souběžně elutující deriváty, včetně izotopicky značených standardů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšené chromatografické rozlišení usnadňuje detekci a kvantifikaci stopových metabolitů
• Přesná hmotnost podporuje jednoznačnou identifikaci i u blízce příbuzných látek
• Možnost rychlé změny mezi 1D a 2D módy poskytuje flexibilitu pro různé výzkumné aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení GC×GC-HRT v integrovaných metabolomických platformách, rozvoj automatizované přípravy vzorků a využití strojového učení pro analýzu komplexních datových sad a objev nových biomarkerů.

Závěr

Pegasus GC-HRT 4D ve spojení s ChromaTOF-HRT softwarem představuje výkonnou kombinaci pro důkladné metabolomické profilování kvasinek. Vysoký chromatografický výkon a přesná hmotnostní spektrometrie výrazně posouvají hranice objevitelských workflow ve výzkumu a vývoji.

Reference

• Chambers P.J. a Pretorius I.S. Fermenting knowledge: the history of winemaking, science and yeast research. EMBO reports 2010, 11(12), 914–920.
• Araque E. et al. Selection of thermotolerant yeast strains Saccharomyces cerevisiae for bioethanol production. Enzyme Microb Technol 2008, 43, 120–123.
• Raab A.M. et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the biotechnological production of succinic acid. Metab Eng 2010, 12(6), 518–525.
• Porro D. et al. Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts. Appl Environ Microbiol 1999, 4211–4215.