A unique tool for metabolite research Q Exactive GC coupled with IRMS (QE GC-IRMS)

Význam tématu

Gas chromatografie spojená s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií a izotopovým poměrem (GC-IRMS) umožňuje citlivé sledování deuterem značených metabolitů a současně poskytuje strukturní informace díky ultra vysoké hmotnostní přesnosti. Tato metodika je zásadní pro farmakokinetické studie léčiv, sportovní dopingový monitoring a objevování nových metabolitů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní workflow kombinující Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap s GC-IRMS (Delta V Plus) pro současné stanovení izotopického značení a strukturní analýzu metabolitů. Metoda byla ověřena na eliminačních studiích s deuterem značeným testosteronem (D2T a D3T) ve vzorcích lidské moči.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči podstoupily enzymatickou hydrolyzu, frakcionaci na HPLC a následnou derivatizaci pomocí MSTFA. Chromatografická separace proběhla na GC Trace 1310 s kolonkou TraceGold TG-5MS (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm). Poměr rozdělení výtoku na IRMS a Q Exactive GC byl 5:1. Detekce zahrnovala:

• GC-IRMS: Delta V Plus s GC IsoLink II, ConFlo IV, vysokoteplotní konverze při 1420 °C
• HR/AM MS: Q Exactive GC Orbitrap, EI ionizace, full scan 50–500 m/z, rozlišení 120 000
• Software: Isodat 3.0.94 pro IRMS, Xcalibur a Trace Finder 4.0 pro GC-MS

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila detekci více než 70 testosteronových metabolitů s citlivostí pod 1 ng/mL. Byl objeven dosud nepopsaný metabolit s methylací steroidního jádra (T_METH), potvrzený vysokou přesností měření m/z 304,2371 a fragmentační analýzou. Eliminační studie s D2T a D3T ukázaly, že methylovaný metabolit obsahuje vždy dva atomy deuteria, což pomohlo lokalizovat methylaci na hydroxylovou funkci.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• Simultánní sledování izotopického značení a detailní strukturální charakterizaci
• Vysokou citlivost a přesnost vhodnou pro sportovní doping a farmakokinetiku
• Rychlejší objevování a validaci metabolitických biomarkerů

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další izotopická značení, jiné třídy léčiv a komplexnější biologické matice. Zvýšení podílu značeného substrátu nebo integrace s dalšími HRMS technikami může dále zlepšit citlivost a specifičnost. Syntéza nově objevených metabolitů podpoří konečné potvrzení jejich struktur.

Závěr

Kombinace Q Exactive GC Orbitrap a GC-IRMS představuje efektivní nástroj pro metabolitický výzkum, kombinující izotopovou analýzu a vysokorozlišovací strukturní data v jednom běhu. Tento přístup urychluje identifikaci nových metabolitů a podporuje farmaceutický vývoj i antidopingové kontroly.

Reference

1. Thevis M, Piper T, Horning S, Juchelka D, Schänzer W. Hydrogen isotope ratio mass spectrometry and high-resolution/high-accuracy mass spectrometry in metabolite identification studies: Detecting target compounds for sports drug testing. Rapid Commun Mass Spectrom. 2013;27:1904–1912.
2. Piper T, Mareck U, Geyer H, Flenker U, Thevis M, Platen P, Schänzer W. Determination of 13C/12C ratios of endogenous urinary steroids: method validation, reference population and application to doping control purposes. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008;22:2161–2175.
3. Piper T, Schänzer W, Thevis M. Revisiting the metabolism of 19-nortestosterone using isotope ratio and high resolution/high accuracy mass spectrometry. J Steroid Biochem Mol Biol. 2016;162:80–91.
4. Piper T, Schänzer W, Thevis M. Genotype-dependent metabolism of exogenous testosterone – new biomarkers result in prolonged detectability. Drug Test Anal. 2016;8:1163–1173.