Strategies for Targeted and Non-Targeted Screening and Differentiation of Cannabis Cultivars Using UPLC and APGC with Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry

Význam tématu

Komplexní chemické mapování odrůd konopí je klíčové pro zabezpečení konzistentní kvality a účinnosti produktů využívaných v medicíně i průmyslu. Analytické rozlišení kanabinoidů a terpenů umožňuje nejen ověřit obsah hlavních účinných látek, ale i odhalit vedlejší či méně známé složky, které mohou ovlivnit farmakologický účinek či senzorické vlastnosti. Současné trendy ve farmaceutické a potravinářské praxi vyžadují rychlé, citlivé a spolehlivé metody schopné zpracovat velké množství vzorků s minimálními zásahy operátora.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat workflow pro cílené i necílené (targeted i non-targeted) screenování a odlišení 18 konopných kultivarů (včetně průmyslového konopí) pomocí kombinace UPLC-TOF-MS a APGC-TOF-MS. Studie sledovala:

• vyvinutí a validaci extrakčních protokolů pro kanabinoidy a terpeny,
• vytvoření vlastní databáze přesných hmotností, fragmentů a retenčních časů,
• využití multivariační analýzy (PCA) k diferenciaci odrůd,
• identifikaci známých i neznámých markerů a jejich relativní kvantifikaci.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci kanabinoidů: 0,1 g homogenizovaného květu konopí ve 5 mL acetonitrilu, následuje homogenizace, odstřeďování a ředění 1:10.
Pro extrakci terpenů: 0,1 g materiálu ve 5 mL ethylacetátu, sonikace, odstřeďování a přenos do autosampler lahviček.
Separace a detekce:

• UPLC: ACQUITY UPLC I-Class s kolonnou CSH Phenyl-Hexyl 2,1×100 mm, gradient 45–1 % vody s 0,1 % FA/ACN s 0,1 % FA, průtok 0,6 mL/min, teplota 30 °C.
• APGC-GC: Agilent 7890B + 7693A, kolona Restek Rxi-5MS 20 m×0,18 mm×0,18 µm, helium 0,4 mL/min, injekce 1 µL split 20:1, program 40 °C→325 °C.
• Mass spektrometrie: Xevo G2-XS QToF MS, ESI+ (100–1200 Da) a APGC+ (40–500 Da) v režimu MSE, sběr přesných hmotností prekurzorů i fragmentů.

Software: MassLynx 4.2 pro akvizici, Progenesis QI pro zpracování dat a tvorbu databáze, EZinfo pro rozšířené multivariační analýzy.

Hlavní výsledky a diskuse

PCA UPLC-MS dat odlišila průmyslové konopí (vysoké CBD, nízký D9-THC) od D9-THC bohatých odrůd. Bez průmyslového konopí dále jednotlivé odrůdy segregovaly podle obsahu THCA, THCV, CBG, CBGA a dalších kanabinoidů. Vrámci necílené analýzy byl objeven neznámý marker 9,20 min/374,2463 Da s významnou expresí v odrůdě Josh D OG, navržené složení C23H34O4.
PCA APGC-MS dat ukázala skupiny odrůd s příznaky monoterpenů (β-pinene, terpinoleny, ocimeny) a seskviterpenů (caryophyllene oxide, humulene). Korelační analýza prokázala shody profilů β-pinenu, myrcenu a α-pinenu v odrůdách HumP, HeadB, LOGH, SourH.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• vysokou selektivitu a jistotu identifikace díky souběžnému sběru prekurzorových i fragmentačních dat,
• široké pokrytí roztodivných kanabinoidů a terpenů,
• možnost cíleného i necíleného screenování s jednoduchou tvorbou knihoven,
• různorodé nástroje pro vizualizaci a multivariační interpretaci trendů a markerů,
• potenciál pro rutinní QA/QC, výzkumné studie i vývoj nových kultivarů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření databází o nové kanabinoidy a terpeny, implementace kontrolovaného pěstebního prostředí pro omezení biologické variability a integrace chemotypování s genotypovými daty. Automatizace extrakce a zpracování dat a propojení s pokročilými LIMS systémy umožní zpracování větších souborů vzorků s vyšší efektivitou.

Závěr

Popsané workflow pro UPLC-TOF-MS a APGC-TOF-MS s podpůrnou softwarovou sadou Progenesis QI a EZinfo prokázalo schopnost cíleně i necíleně profilovat a odlišovat konopné kultivary na základě kanabinoidních a terpenových fingerprintů. Metoda přináší vysokou analytickou jistotu, flexibilitu v rozšiřování databází a detailní multivariační přístup pro objev nových markerů.

Reference

1. Bhat SV, Nagasampagi BA, Sivakumar M. Chemistry of Natural Products. 2005.
2. Koltai H, Poulin P, Namdar D. Promoting Cannabis Products to Pharmaceutical Drugs. Eur J Pharm Sci. 2019;132:118–120.
3. Izzo AA, Borrelli F, Capasso R, Di Marzo V, Mechoulam R. Non-Psychotropic Plant Cannabinoids: Trends Pharmacol Sci. 2009;30(10):515–527.
4. Andre CM, Hausman JF, Guerriero G. Cannabis Sativa: The Plant of the thousand and one molecules. Front Plant Sci. 2016;7:19.
5. ElSohly MA, Slade D. Chemical Constituents of Marijuana. Life Sci. 2005;78:539–548.
6. Brenneisen R. Chemistry and Analysis of Phytocannabinoids and Other Cannabis Constituents. Marijuana and the Cannabinoids. 2007:17–49.
7. Citti C, Linciano P, Russo F, et al. A Novel Phytocannabinoid Isolated from Cannabis Sativa L. Sci Rep. 2019;9:20335.
8. Radwan MM, ElSohly MA, Slade D, et al. Biologically Active Cannabinoids from High Potency Cannabis Sativa. J Nat Prod. 2009;72:906–911.
9. Citti C, Braghiroli D, Vandelli MA, Cannazza G. Pharmaceutical and Biomedical Analysis of Cannabinoids: A Critical Review. J Pharm Biomed Anal. 2018;147:565–579.
10. Lewis MM, Yang Y, Wasilewski E, et al. Chemical Profiling of Medical Cannabis Extracts. ACS Omega. 2017;2:6091–6103.
11. Fischedick JT, Hazekamp A, Erkelens T, Choi YH, Verpoorte R. Metabolic Fingerprinting of Cannabis sativa L. Phytochemistry. 2010;71:2058–2073.
12. Hazekamp A, Fischedick JT. Cannabis – From Cultivar to Chemovar. Drug Test Anal. 2012;4:660–667.
13. Hazekamp A, Tejkalova K, Papadimitriou S. Cannabis: From Cultivar to Chemovar II. Cannabis Cannabinoid Res. 2016;1(1):202–215.
14. Berman P, Futoran K, Lewitus GM, et al. A New ESI-LC/MS Approach for Comprehensive Metabolic Profiling of Phytocannabinoids. Sci Rep. 2018;8:14280.
15. Russo EB. Taming THC: Potential Cannabis Synergy and Phytocannabinoid-Terpenoid Entourage Effects. Br J Pharmacol. 2011;163:1344–1364.
16. Delgado-Povedano MM, Sanchez-Carnerero C, Priego-Capote F. Untargeted Characterisation of Extracts from Cannabis Sativa L. Talanta. 2020;208:120384.
17. Elzinga S, Fischedick J, Podkolinski R, Raber JC. Cannabinoids and Terpenes as Chemotaxonomic Markers in Cannabis. Nat Prod Chem Res. 2015;3:4.
18. Elzinga S, Raber JC. Standardized analytical methods for cannabinoids and terpenes in cannabis. Nat Prod Chem Res. 2018;6:304.
19. Hillig KW. A Chemotaxonomic Analysis of Terpenoid Variation in Cannabis. Biochem Syst Ecol. 2004;32:875–891.
20. Fischedick JT. Identification of Terpenoid Chemotypes Among High-THC Producing Cannabis Sativa L. Cannabis Cannabinoid Res. 2017;2:34–47.
21. Orser C, Johnson S, Speck MD, Afia I. Terpenoid Chemoprofiles Distinguish Drug-Type Cannabis Sativa L. cultivars in Nevada. Nat Prod Chem Res. 2018;6:304.
22. Booth J, Bohlman J. Terpenes in Cannabis Sativa – From Plant Genome to Humans. Plant Sci. 2019;284:67–72.
23. Berman P, Futoran K, Lewitus GM, et al. Future of cannabis metabolomics. Sci Rep. 2018;8:14280.
24. Navarro G, Varani K, Reyes-Resina I, et al. Cannabigerol Action at Cannabinoid CB1 and CB2 Receptors. Front Pharmacol. 2018;9:632.
25. Hao DC, Gu XJ, Xiao PG. Medicinal Plants: Chemistry, Biology and Omics. Phytochem Biol Res Cannabis Pharm Res. 2015;431–464.
26. Storey JD, Tibshirani R. Statistical Significance for Genomewide Studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9440–9445.
27. Ibrahim EA, Wang M, Radwan MM, et al. Analysis of Terpenes in Cannabis Sativa L. Using GC/MS. Planta Med. 2019;85:431–438.
28. Magagnini G, Grassi G, Kotiranta S. The Effect of Light Spectrum on Morphology and Cannabinoid Content of Cannabis Sativa L. Med Cannabis Cannabinoids. 2018;1:19–27.
29. Stevens D, Hudalla CJ, Twohig M, Organtini K. Terpenes in Hemp and Cannabis Determined Using EI GC-MS/MS. Waters Application Note. 2020.