Comprehensive Measurement of Metabolites Using GC-MS/MS and LC-MS/MS

Význam tématu

Střevní mikrobiota hraje klíčovou roli v metabolických procesech, ovlivňuje imunitní systém, vstřebávání látek a mohou se podílet na vzniku i prevenci onemocnění. Komplexní profil metabolitů ve vzorcích stolice umožňuje hlubší porozumění interakcím mezi hostitelem a mikrobiální komunitou, a tím přispívá k rozvoji lékařského výzkumu i potravinářských aplikací.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje metodiku kombinované analýzy primárních metabolitů extrahovaných z myší stolice pomocí GC-MS/MS a LC-MS/MS. Cílem je dosáhnout širšího pokrytí analytů než při použití jediné techniky, ověřit opakovatelnost měření a demonstrovat aplikaci na porovnání metabolomů mladých a starých myší.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorku:

• Sběr čerstvých stolních vzorků od myší C57BL/6J (50 mg vzorku).
• Extrakce přidáním 450 µL PBS, míchání, odstředění, ultrafiltrace.
• Pro GC-MS/MS - derivatizace podle pokynů („Pretreatment Procedure Handbook“).
• Pro LC-MS/MS - desetinné naředění filtru 1 : 10 bez derivatizace.

Instrumentace:

• GC-MS/MS: GCMS-TQ 8040 se Smart Metabolites Database (475 MRM přechodů).
• LC-MS/MS: LCMS-8040 a LCMS-8050 s iontově-párovací i neiontově-párovací metodou z balíčku LC/MS/MS Method Package for Primary Metabolites ver. 2.

Hlavní výsledky a diskuse

GC-MS/MS detekovalo 100 metabolit (organické kyseliny, krátké mastné kyseliny, cukry), LC-MS/MS identifikovalo až 152 dalších látek (amino kyseliny, nukleotidy, intermediáty glykolýzy, TCA cyklu, pentózového cyklu). Opakovatelnost (RSD) většiny analyzovaných složek byla pod 10 %. Kombinace obou technik přinesla ucelený profil sekundárních i primárních metabolitů.

Aplikace na model stárnutí:
Porovnání stolice mladých (10 týdnů) a starých (70 týdnů) myší ukázalo signifikantní rozdíly u 66 metabolitů. Ve starších myších byla nižší hladina žlučových kyselin (např. cholic acid, taurocholic acid), indikující sníženou dekonjugaci nebo sekreci žlučových kyselin. Naopak arginin byl zvýšen u starších jedinců, což může souviset se změněnou proliferací bakterií či absorpcí aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

Metodika umožňuje komplexní sledování metabolomických změn ve stolici s vysokou citlivostí a reprodukovatelností. Vhodná pro:

• Studium interakcí hostitel–mikrobiom.
• Identifikaci biomarkerů onemocnění či stárnutí.
• Hodnocení účinků funkčních potravin a prebiotik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší integrace s dalšími „omics“ přístupy, vývoj rychlejších derivatizačních protokolů a pokročilé datové analýzy založené na strojovém učení. Rozšíření databází MRM přechodů a standardizace protokolů povede k rychlejší validaci biomarkerů ve studiích na lidech.

Závěr

Kombinované využití GC-MS/MS a LC-MS/MS nabízí robustní platformu pro komplexní metabolomickou analýzu stolice. Metody prokázaly vysokou reprodukovatelnost a široké spektrum detekovaných látek. Jejich aplikace na model stárnutí demonstrovala schopnost odhalit biologicky relevantní změny.

Reference

1. M. Matsumoto et al., Scientific Reports 2, 223 (2012).