Screening of organic acids for nutritional and metabolic profiling from dried urine spots using Gas Chromatograph Mass Spectrometer

Význam tématu

Organické kyseliny jsou klíčovými intermediáty řady metabolických drah včetně Krebsova cyklu a mikrobiálních procesů ve střevech. Analýza jejich koncentrací v moči přináší hodnotné informace o nutričním stavu, mikrobiomu a možnostech časné detekce metabolických či gastrointestinálních poruch.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit rychlou a spolehlivou metodu skríninku až 65 organických kyselin z vysušených kapek moči (dried urine spots) pomocí plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC–MS) systému Shimadzu GCMS-QP2020 NX. Metoda využívá databázi Smart Metabolites DatabaseTM Ver.2 a funkci Automatic Adjustment of Retention Time (AART) pro automatické přizpůsobení retenčních časů a přesnou identifikaci.

Použitá instrumentace

• Shimadzu GCMS-QP2020 NX
• Automatický vkladač vzorků AOC-20i+s
• Kolona SH-Rxi-5Sil MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm)
• Restek TopazTM Liner (s vlnou)
• Metoda ionizace: EI, skenovací rychlost 20 000 u/s

Použitá metodika

Vzorek moči určený podle koncentrace kreatininu se zpracoval takto:

• Normace objemu vzorku a přidání interních standardů (tridekanová a margarová kyselina)
• Hydrolýza urey pomocí ureázy (37 °C, 30 min)
• Deproteinace ethanolem, centrifugace (3 000 rpm, 4 °C, 5 min) a odpaření supernatantu pod N2 při 60 °C
• Derivatizace BSTFA s 1 % TMCS (80 °C, 30 min)
• Injekce 1 μl do GC–MS v režimu split, programovaná teplota kolony od 60 °C do 310 °C, dobu běhu ~23,7 min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila kvalitativní identifikaci až 65 organických kyselin v matici vysušené moči. Použití AART a lineárního retenčního indexu zvýšilo přesnost identifikace oproti klasickým spektrálním knihovnám. Rekapitulace klíčových bodů:

• Celkový iontový chromatogram ukázal dobře separované píky 65 kyselin.
• Porovnání masových spekter s databází Smart Metabolites snížilo falešně pozitivní a negativní nálezy.
• Příklad bibliografické studie odhalil význam fosforečné kyseliny jako biomarker při onemocnění SLE.
• Kalibrační křivky (např. pro kyselinu glutárovou) pro kvantitativní analýzu vykazují vysokou linearitu.

Přínosy a praktické využití

Metoda nabízí:

• Rychlý skrínink nutričních a metabolických markerů z malého objemu vzorku.
• Jednoduchou přípravu vzorku z filtrových papírků i čerstvé moči.
• Možnost využití v klinických laboratořích pro monitoring střevní mikroflóry, diagnostiku poruch vstřebávání živin a v nutraceutickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje:

• Rozšíření databází metabolit a integrace s umělou inteligencí pro automatizovanou analýzu profilů.
• Vysokoprůchodnost (high-throughput) pro rutinní klinické a výzkumné aplikace.
• Propojení GC-MS dat s dalšími analytickými technikami (LC–MS, NMR) pro komplexní metabolomiku.
• Personalizované hodnocení výživy na základě individuálních metabolických fingerprintů.

Závěr

Vyvinutá metoda GC–MS skríninku organických kyselin z vysušených kapek moči pomocí Shimadzu GCMS-QP2020 NX poskytuje rychlý, robustní a přesný přehled metabolického profilu. Nasazení databáze Smart Metabolites a AART výrazně zefektivnilo identifikaci a podporuje širší využití v klinických a nutrigenomických studiích.

Reference

• Naraian R., Kumari S. Microbial production of organic acids. Microbial Functional Foods and Nutraceuticals, 2017.
• Suiryanrayna M.V., Ramana J.V. A review of the effects of dietary organic acids fed to swine. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2015;6(1):1-11.
• Yan R. et al. Fecal metabolites were altered, identified as biomarkers and correlated with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus in a GC-MS-based metabolomics study. Frontiers in Immunology, 2020;11:2138.