Optimizing tissue preparation and storage for analysis of polyunsaturated fatty acids using Agilent’s FTIR imaging systems

Význam tématu

Poly­nena­sycené mastné kyseliny (PUFA), jako je DHA, EPA a AA, hrají klíčovou roli v biochemických procesech mozku a sítnice. Jejich oxidativní degradace může ovlivnit interpretaci výsledků při studiu neurodegenerativních onemocnění. FTIR zobrazování umožňuje mapovat rozložení PUFA na subbuněčné úrovni, a proto je optimalizace přípravy a uchovávání vzorků zásadní pro spolehlivou analýzu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo sledovat rychlost oxidace PUFA v tenkých řezech myší sítnice za různých skladovacích podmínek a navrhnout protokoly minimalizující ztrátu biomarkerů pro přesné FTIR měření.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky sítnice (7 µm) z divokého typu myši byly kryokrájeny, umístěny na MirrIR podložky nebo BaF2 okénka a skladovány při –70 °C. Pro měření byly po rozmražení a vysušení uloženy v temnu při pokojové teplotě a snímkovány v čase následujících intervalů:

• FTIR mikroskop Agilent Cary 620 s 64×64 pixelovou FPA detekcí (5,5 µm/pixel),
• Agilent Cary 670 FTIR spektrometr, spektrální rozsah 4000–900 cm⁻¹, rozlišení 4 cm⁻¹, 256 skenů na spektrum,
• Režimy: reflexe (MirrIR) a průchod (BaF2),
• Analýza dat: Agilent Resolutions Pro a vlastní software.

Hlavní výsledky a diskuse

FTIR obrazy pro pásmo olefínového C=C–H (3012 cm⁻¹) ukázaly:

• Nejvyšší koncentrace PUFA v disku mikrodisků tyčinek (ROS) sítnice.
• Po 12 hodinách od rozmražení bylo dosaženo prvního měření, následně u normálního skladování (temno, pokojová teplota) 3, 7, 15, 31 a 272 dní.
• Pokles intenzity olefínového pásma o ~8 % během prvních 2 týdnů, ~15 % po měsíci a pod jednu třetinu původní hodnoty po 8 měsících.
• Menší, ale významný pokles karbonylového pásma (1735 cm⁻¹) a změny ve spektru OH stretch naznačující vznik nových oxidačních produktů.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované FTIR zobrazování přináší:

• Prostorové rozlišení PUFA na subbuněčné úrovni v biologických tkáních.
• Kvantitativní sledování degradace při běžných laboratorních podmínkách.
• Návod na minimalizaci podhodnocení PUFA analýzou čerstvých vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit o:

• FTIR zobrazování dalších lipidových tříd v různých tkáních.
• Automatizované SPME nebo inline spektroskopické techniky pro vysokopropustné analýzy.
• Multimodální zobrazování kombinující FTIR s Ramanovou spektroskopií či hmotnostní spektrometrií.

Závěr

Pro co nejpřesnější měření PUFA v tkáňových řezech je nezbytné co nejdříve po rozmražení a vysušení provést FTIR zobrazování v temnu. Delší skladování vede k významné oxidaci a podhodnocení obsahu PUFA.

Reference

1. Fraser T., Taylor H., Love S. Neurochem. Res. 35, 503–513 (2010)
2. Hartmann T., Kuchenbecker J., Grimm M. O. W. J. Neurochem. 103, 159–170 (2007)
3. Stitt D. M., Kastyak-Ibrahim M. Z., Liao C. R., Morrison J., Albensi B. C., Gough K. M. Tissue acquisition and storage associated oxidation considerations for FTIR microspectroscopic imaging of polyunsaturated fatty acids. Vib. Spectrosc. 60, 16–22 (2012)