Protein Secondary Structure Estimation Using the Agilent Cary 630 FTIR Spectrometer

Význam tématu

Proteiny plní klíčové funkce díky schopnosti navazovat charakteristické sekundární struktury (α-helix, β-sheet, coil). Jejich přesné stanovení je zásadní pro pochopení biologické aktivity a stabilitu bílkovin ve výzkumu, farmaceutické výrobě i biotechnologii. Tradiční metody (X-ray, CD) mají omezení kvůli náročné přípravě nebo koncentraci vzorku, kdežto FTIR-ATR umožňuje rychlé a flexibilní stanovení sekundární struktury přímo ve vodném roztoku.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit použití Agilent Cary 630 FTIR spektrometru s ATR a softwaru MicroLab Expert pro kvantitativní odhad sekundární struktury bílkovin ve vodných roztocích. Provedeno bylo porovnání výsledků FTIR s literárními daty získanými rentgenovou krystalografií u šesti modelových proteinů.

Použitá instrumentace

• FTIR spektrometr Agilent Cary 630 se single-reflection diamantovým ATR modulem
• Softwarový balík Agilent MicroLab Expert verze 1.1.0.1

Použitá metodika

Vzorky bílkovin (BSA, lysozym, papain, β-casein, myoglobin, IgG) byly připraveny v koncentracích 10–25 mg/ml. Spektra byla sbírána v rozsahu 4000–650 cm–1 při rozlišení 4 cm–1 a 140 skenech. Při zpracování dat se aplikovalo:

• odečtení spektra vodné matrix
• vyhlazení (Savitzky-Golay, okno 9, polynom 3)
• druhá derivace pro zdůraznění skrytých vrcholů
• korekce báze v oblasti amide I (1600–1700 cm–1)
• křivkové fitování jednotlivých komponent (FWHM, pozice vrcholu, plocha)

Hlavní výsledky a diskuse

FTIR křivkové fitování odhalilo rozdělení sekundárních struktur:

• IgG: 67 % β-sheet (vrchol ~1636 cm–1)
• Lysozym: 44 % α-helix (vrchol 1654 cm–1), 19 % β-sheet
• Myoglobin: dominantní α-helix (~72 %) doplněný β-sheet (~23 %)
• BSA: nižší α-helix (38 %) proti krystalografii (74 %) vlivem prostředí ve vodném roztoku
• Papain, β-casein: mix různých struktur a vyšší podíl náhodných coil

Výsledky je možné vysvětlit vlivem vodného prostředí, pH a termodynamických podmínek, které ovlivňují vodíkové vazby a stabilitu sekundární struktury.

Přínosy a praktické využití metody

FTIR-ATR-Cary 630 nabízí rychlou, neinvazivní a snadno proveditelnou analýzu sekundární struktury bílkovin v řešení. Nízké množství vzorku a minimální příprava umožňují aplikaci v:

• monitoringu stability proteinových formulací
• screeningu konformace během vývoje léčiv
• kontrole kvality v biotechnologii a potravinářství

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace FTIR s chemometrickými nástroji pro automatizovanou analýzu, rozšíření na online a real-time monitorování v bioreaktorech a spojení s microfluidními systémy pro vysoce propustné screeningy proteinových vzorků.

Závěr

Metoda FTIR-ATR na Agilent Cary 630 ve spojení s MicroLab Expert představuje spolehlivý nástroj pro kvantitativní odhad sekundární struktury bílkovin v roztoku. Srovnání s krystalografickými daty ukázalo dobrou konzistenci a zdůraznilo potenciál této techniky pro rychlé a flexibilní aplikace v oblasti výzkumu i průmyslové analýzy.

Reference

• Barth A. Infrared Spectroscopy of Proteins. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2007;1767(9):1073–1101.
• Greenfield NJ. Using Circular Dichroism Spectra to Estimate Protein Secondary Structure. Nat Protoc. 2006;1(6):2876–2890.
• Shi Y. A Glimpse of Structural Biology Through X-Ray Crystallography. Cell. 2014;159(5):995–1014.
• Jackson M, Mantsch HH. The Use and Misuse of FTIR Spectroscopy in the Determination of Protein Structure. Crit Rev Biochem Mol Biol. 1995;30:95–120.
• Levitt M, Greer J. Automatic Identification of Secondary Structure in Globular Proteins. J Mol Biol. 1977;114:181–239.
• Kamphuis IG et al. Structure of Papain Refined at 1.65 Å Resolution. J Mol Biol. 1984;179:233–256.
• Majorek KA et al. Structural and Immunologic Characterization of Bovine, Horse, and Rabbit Serum Albumins. Mol Immunol. 2012;52:174–182.
• Barreto MSC et al. The Molecular Insights into Protein Adsorption on Hematite Surface Disclosed by In-Situ ATR-FTIR/2D-COS study. Sci Rep. 2020;10:13441.
• Abrosimova KV et al. FTIR Study of Secondary Structure of Bovine Serum Albumin and Ovalbumin. J Phys: Conf Ser. 2016;769:012056.