Rapid phenotypic identification of microorganisms with Raman

Význam tématu

Rychlá fenotypová identifikace mikroorganismů je klíčová v potravinářském průmyslu, ekologické remediaci i biotechnologiích. Tradiční genetické metody jsou nákladné a časově náročné. Ramanova spektroskopie nabízí rychlou, nedestruktivní alternativu, která umožňuje přímé měření bakterií na pevném kultivačním médiu a sledování jejich metabolitů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem application note bylo demonstrovat použití přenosných Ramanových spektrometrů Metrohm (i-Raman Prime 785 a i-Raman EX) pro fenotypickou identifikaci bakteriálních kolonií přímo na LB agarovém médiu. Studie zahrnovala sběr spekter z různých bakteriálních populací, porovnání excitace při 785 a 1064 nm a diferenciaci fenotypicky odlišných kolonií.

Použitá metodika a instrumentace

Pro kultivaci bakterií bylo použito LB agarové médium připravené dle specifikací výrobce. Vzorky byly inokulovány otiskem prstu na povrch agarových destiček a inkubovány při pokojové teplotě. Sběr Ramanových spekter probíhal pomocí následujících přístrojů:

• i-Raman Prime 785 (785 nm laserová excitace)
• i-Raman EX (1064 nm laserová excitace)
• BAC150B držák sondy
• BAC151C video mikroskop s 50× objektivem
• SW BWSpec pro sběr dat a základní analýzu

Parametry sběru spekter se pohybovaly v rozmezí laserového výkonu 30 – 100 %, integračních časů 3 – 60 s a průměrování 3 – 5 měření podle charakteru kolonie.

Hlavní výsledky a diskuse

Ramanova spektra bakteriálních kolonií identifikovala charakteristické peaky pro aminokyseliny (1001, 1156, 1654 cm⁻¹), komponenty nukleových kyselin (723, 669, 1337 cm⁻¹) a další biomolekuly. Excitace při 785 nm poskytla vyšší intenzity a ostřejší signály díky vyšší účinnosti čidla CCD. Excitace při 1064 nm snižuje vliv fluorescenčního rušení u tmavých substrátů. Fenotypicky odlišné kolonie (žluté a bílé) vykázaly rozdílné spektrální profily, což umožnilo jejich rozlišení. Analýza pomocí PCA ukázala jasnou separaci dat na základě barviva žlutých kolonií a rozdílů v chemickém složení.

Přínosy a praktické využití metody

Ramanova spektroskopie umožňuje:

• Okamžitou, bezkontaktní identifikaci bakterií přímo na kultivačním médiu
• Sledování metabolických změn a akumulace látek (např. polyfosfátů, glykogenu)
• Uplatnění v laboratořích QA/QC, potravinářství, životním prostředí i biotechnologiích
• Minimalizaci spotřeby vzorku a redukci doby analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj strojového učení a pokročilých multivariačních metod (např. pokročilé PCA, LDA, neuronové sítě) umožní detekci jemných spektrálních odchylek a charakterizaci složitých mikrobiálních společenstev. Integrace se softwarem pro hromadnou analýzu dat a cloudovými platformami zvýší automatizaci a reprodukovatelnost výsledků v terénu i v laboratoři.

Závěr

Application note demonstruje, že přenosné Ramanovy spektrometry Metrohm poskytují rychlou, citlivou a nedestruktivní metodu pro fenotypickou identifikaci bakterií na kultivačním médiu. Výběr excitace 785 nm nebo 1064 nm lze optimalizovat podle prostředí a charakteru vzorku. Metoda nachází uplatnění ve výzkumu i rutinní analýze.

Reference

1. Paret M. L., Sharma S. K., Green L. M. et al. Biochemical Characterization of Gram-Positive and Gram-Negative Plant-Associated Bacteria with Micro-Raman Spectroscopy. Appl Spectrosc. 2010;64(4):433–441. DOI:10.1366/000370210791114293