Gas analysis mass spectrometer applications in fermentation and cell culture processes

Význam tématu

Analýza výměny plynů u fermentačních a buněčných kultur je klíčovým prvkem pro monitorování fyziologického stavu kultury, optimalizaci výtěžku a zavedení online řízení procesu (PAT, APC). Měření koncentrací O2, CO2, N2, Ar a stopových organických látek v nádechovém a výdechovém plynu poskytuje neinvazivní, rychlé a kontinuální informace o spotřebě substrátů, produkci metabolitů, respirační aktivitě a možném znečištění kultury. To je zvlášť důležité při přechodu z laboratorního měřítka na pilotní a průmyslovou výrobu, kde konzistence a korelace dat mezi stupni měřítka rozhoduje o úspěšné škálovatelnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Text popisuje využití plynové hmotnostní spektrometrie (MS) — především magnetického sektorového typu (Thermo Scientific Prima BT a Prima PRO) — jako nástroje PAT pro monitorování fermentací a kultivací savčích buněk. Hlavními cíli jsou prezentovat přednosti magnetického sektorového MS oproti kvadrupolovým systémům, ukázat metodiky výpočtu respirace (CER, OUR, RQ), demonstrovat dlouhodobou stabilitu a schopnost měřit stopové organické sloučeniny a popsat integraci do vícestanicového měření (RMS). Dále jsou uvedeny aplikační příklady z fed-batch fermentací (E. coli, S. cerevisiae) a mammálních CHO kultur.

Použitá metodika a instrumentace

• Magnetický sektorový hmotnostní analyzátor (Prima BT, Prima PRO) – laminovaný sektor pro vysokou stabilitu a rychlé skenování s „flat-top“ profilem píků, což minimalizuje vliv driftu masové škály.
• Rapid Multi-Stream Sampler (RMS) – vyhřívaný multiplexer pro výběr až 64 vzorkovacích větví, s digitálním záznamem průtoku a konfigurovatelnými dobami usazení; optimalizuje rychlost a spolehlivost přepínání mezi fermentory.
• Softwarové nástroje (GasWorks) – výpočet CER, OUR, RQ a vizualizace dlouhodobých trendů; korekce vlivu vlhkosti a rozředění pomocí inertních plynů (N2 nebo Ar).
• Příklady provozních parametrů – cykly měření: např. 5 s pro 4 komponenty v kontinuálním testu; standardně ~30 s na proud při měření 6 složek (10 s bez methanolu/ethanolu). Přesnost a rozsahy: N2/O2 typicky 0–100 %mol s přesností ~0.005 %mol, Ar ~0–1 % s 0.001 %mol, CO2 do 10 % s relativní přesností 0.1 %; detekce methanolu/ethanolu v řádu desítek ppm (metodicky korekce za stopu zpoždění z O2 píků).

Hlavní výsledky a diskuse

• Dlouhodobá stabilita: v testu kontinuální analýzy stlačeného vzduchu po 7 dnech bez přerušení dosahoval sektorový MS den-to-den variability O2 a N2 ve stovkách ppm (O2 ~0.002–0.003 %mol), CO2 v jednotkách ppm (±~1 ppm). Taková stabilita umožňuje detekci menších, biologicky významných změn.
• Výhody magnetického sektoru: výrazně nižší drift oproti kvadrupolu, vyšší analytická přesnost (2–10× lepší v závislosti na analytech a matici), delší intervaly mezi kalibracemi a lepší opakovatelnost u definovaných masových pozic.
• Respirační metriky: MS měří vstupní i výstupní toky plynů a složení, umožňuje vypočítat CER (CO2 evolution rate), OUR (O2 uptake rate) a RQ = CER/OUR. RQ slouží k rozpoznání metabolické dráhy (např. cukry vs. lipidy) a stavů jako přechod k produkci nebo zvýšenému odbourávání substrátu.
• Analýza těkavých organických sloučenin (VOCs): měření methanolu a ethanolu při stopových hladinách naráží na interferenci píků O2 (např. O2 pík na m/z 32 má „ocas“, který ovlivní signál na m/z 31). Magnetický sektor umožňuje stabilní korekce a opakovatelné měření až do řádu 10 ppm, zatímco kvadrupoly vykazují větší variabilitu a vyšší nejistotu při nízkých hladinách.
• Aplikační příklady: U S. cerevisiae a E. coli fed-batch kultur MS poskytl kontinuální RQ a VOC data, která pomohla sledovat přepínání zdrojů uhlíku a indukci exprese. V mammálních CHO kulturách, kde se složení vstupního plynu aktivně mění (přídavky CO2, O2, překrytí overlay plynem), poskytlo MS klíčové informace vedoucí k úpravě pufrování/přivádění CO2 a následnému nárůstu Viable Cell Count (VCC) a prodloužení kultivační doby.

Přínosy a praktické využití metody

• Online, neinvazivní monitorování fyziologického stavu kultury a včasná detekce změn nebo kontaminací porovnáním sparge (vstup) vs. effluent (výstup).
• Možnost integrace do APC systémů pro řízení O2/CO2 a vhodný timing sklizně/indukce s rychlou návratností investice (zpravidla dny od instalace ke zlepšenému řízení).
• Schopnost sledovat mnoho fermentorů současně (Prima PRO: 60+ reaktorů), ušetřit náklady a zlepšit konzistenci mezi laboratorním a výrobním měřítkem.
• Měření VOC na úrovních relevantních pro metabolickou analýzu a detekci rozpadu/klasifikace kontinuálních změn metabolismu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace s pokročilými algoritmy řízení založenými na strojovém učení pro prediktivní optimalizaci dávkování substrátů a načasování sklizně.
• Rozvoj standardizovaných rozhraní dat a interoperabilních protokolů pro snadnější integraci MS dat do MES/SCADA/APC systémů a FAIR managementu dat.
• Zlepšení detekčních limitů pro širší spektrum VOC a intracelulárních markerů pomocí pokročilé předúpravy vzorku a lepšího oddělení hmotnostních interferencí.
• Rostoucí použití single-use fermentorů a multipoint-vzorkování – potřeba flexibilních RMS řešení a robustní online kalibrace pro zajištění reprodukovatelnosti napříč jednorázovými systémy.

Závěr

Magnetický sektorový procesní hmotnostní spektrometr představuje osvědčenou technologii pro rychlou, přesnou a stabilní analýzu off-gas v bakterálních, kvasinkových i savčích kultivacích. Díky vysoké přesnosti, stabilitě a schopnosti obsluhovat mnoho zdrojů vzorků je zvláště vhodný pro implementaci PAT a pokročilých řídicích strategií napříč škálou od vývoje po průmyslovou výrobu. Praktické přínosy zahrnují lepší kontrolu metabolických stavů, včasnou detekci problémů a jednodušší škálování procesů.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Prima BT – stolní (bench-top) procesní hmotnostní spektrometr pro vývojové a menší provozy (typická konfigurace 15 vzorků a 6 kalibračních portů).
• Thermo Scientific Prima PRO – průmyslový procesní MS vhodný pro monitorování 60+ reaktorů, vybaven laminovaným magnetickým sektorem pro vysokou stabilitu.
• Rapid Multi-Stream Sampler (RMS) – vyhřívaný multiplexor pro až 64 proudů, digitální záznam průtoku, alarmy pro pokles průtoku.
• GasWorks Software – nástroje pro sběr dat, výpočty CER/OUR/RQ a vizualizaci trendů.

Reference

1. M.G. Fári, U.P. Kralovánszky, The founding father of biotechnology: Károly (Karl) Ereky. International Journal of Horticultural Science, Vol. 12, No. 1, pp. 9–12, 2006.
2. D. Pollard, J. Christensen, Vent Gas Analysis, Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology, John Wiley & Sons, 2010.
3. J.S. Alford, Bioprocess control: Advances and challenges, Computers & Chemical Engineering, Volume 30, September 2006.
4. P.C. van der Aar, A.H. Stouthamer, H.W. van Verseveld, Possible misconceptions about O2 consumption and CO2 production measurements in stirred microbial cultures, Journal of Microbiological Methods, Volume 9, Issue 4, June 1989.