Application of GC Orbitrap mass spectrometry for untargeted metabolomics of pathogenic microorganisms

Význam tématu

Patogenní mikroorganismy a jejich biofilmy představují zásadní zdravotní výzvu vzhledem k rostoucí rezistenci na antibiotika a vysoké úmrtnosti. Metabolomická analýza interakcí mezi houbou Candida albicans a bakterií Staphylococcus aureus může odhalit klíčové biochemické dráhy, které podmiňují synergii a zvýšenou virulenci.

Cíle a přehled studie / článku

• Cíl: Zjistit metabolické změny při soužití C albicans a S aureus pomocí neřízené GC-Orbitrap HRMS.
• Studie zahrnovala analýzu kultivačních médií i buněčných extraktů jednotlivě i v ko-kultuře.
• Statistická analýza: PCA, Volcano ploty, porovnání fold-change a p-hodnot.

Použitá metodika

Vzorky byly extrahovány, následně derivatizovány methoximací a silylací ke zvýšení volatility metabolitů. GC-MS analýza probíhala v režimu full-scan s elektronovou ionizací. Data zpracována v Compound Discoverer a TraceFinder pro detekci, dekonvoluci, identifikaci a semikvantifikaci.

Použitá instrumentace

• GC: Thermo Scientific TRACE 1310, kolona TraceGOLD TG-5Sil MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm).
• Autosampler: Thermo Scientific TriPlus RSH robotický systém.
• MS: Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap, EI, full-scan 50–650 Da, rozlišení 60000 při m/z 200, interní lock mass.

Hlavní výsledky a diskuse

• PCA jasně oddělila mediální vzorky od buněčných extraktů a identifikovala odlišné klustery ko-kultury.
• Detekováno přes 17000 chromatografických funkcí, významné variace glycinů, myo-inositolu a sedoheptulóza-7-fosfátu.
• Sedoheptulóza-7-fosfát byla významně zvýšena v ko-kultuře, naznačuje roli v interakcích C albicans a S aureus.

Přínosy a praktické využití metody

Neřízená GC-Orbitrap metabolomika nabízí vysokou citlivost a selektivitu pro široké spektrum nízkomolekulárních metabolitů v komplexních biologických systémech. Metoda umožňuje urychlené objevování biomarkerů a potenciálních cílových látek ve vývoji antimikrobiálních strategií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace GC-MS dat s dalšími omickými přístupy (proteomika, lipidomika).
• Vyšší throughput pomocí kapilárních GC modulů a automatizovaných příprav.
• Personalizovaná diagnostika infeakcí na základě metabolického profilu pacientů.

Závěr

Popsané workflow kombinuje GC-Orbitrap vysoké rozlišení s pokročilým softwarovým zpracováním, což poskytuje reprodukovatelné, plnoskenovací studie neřízené metabolomiky patogenních biofilmů. Metoda nabízí cenný nástroj pro hlubší pochopení mikrobiálních interakcí a vývoj nových léčebných přístupů.

Reference

• Crump JA, Collignon PJ. Intravascular catheter-associated infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000;19:1–8.
• Carlson EC. Synergism of Candida albicans and Staphylococcus aureus on mouse mortality. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A. 1988;269:377–386.
• Morales DK, Hogan DA. Candida albicans Interactions with Bacteria in the Context of Human Health and Disease. PLoS Pathog. 2010;6(4):e1000886.
• Weidt S, Haggarty J, Kean R, Cojocariu CI, Silcock PJ, Rajendran R, Ramage G, Burgess KEV. A novel targeted/untargeted GC-Orbitrap metabolomics methodology applied to Candida albicans and Staphylococcus aureus biofilms. Metabolomics. 2016;doi:10.1007/s11306-016-1134-2.
• Dunn WB et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nat Protoc. 2011;6(7):1060–1083.
• Thermo Fisher Scientific. Untargeted Metabolomics Using Orbitrap-Based GC-MS, Application Note AN10457, 2015.