Metabolic Profiling of Yeast Sterols Using the Agilent 7200 Series GC/Q-TOF System

Význam tématu

Přesné stanovení cílů antifungálních látek v biosyntetické dráze ergosterolu je klíčové pro vývoj nových léčiv. Využití modelového organismu Saccharomyces cerevisiae umožňuje odhalit specifické enzymy rozdílné od lidských, čímž se minimalizuje toxicita. Kombinace genetických screenů a vyspělé GC/Q-TOF analýzy poskytuje komplexní přehled metabolických změn.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit možnost cílené a necílené GC/Q-TOF metabolomické analýzy pro mapování dráhy biosyntézy ergosterolu a identifikaci enzimatických cílů běžných i nových antifungálních látek. Studie porovnávala vliv referenčních látek terbinafinu, flukonazolu a potenciálních inhibitorů (Totarol, NCE 1181-0519) na akumulaci meziproduktů sterolů.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: extrakce lipidů metodou Folch, derivatizace methoxyaminem a MSTFA/TMCS.
• Instrumentace: Agilent 7890A GC spojený s 7200 Series GC/Q-TOF.
• Podmínky GC: kolona HP-5 MS UI 30 m×0,25 mm (0,25 µm), program 60 °C→325 °C, He 1 mL/min.
• Podmínky MS: režim EI, rozlišení vysoké přesnosti hmotnosti, MS/MS kolizní energie 15 V, rozsah 50–600 m/z.
• Software: MassHunter Qualitative a Quantitative, Mass Profiler Professional, Molecular Structure Correlator.

Hlavní výsledky a diskuse

• Referenční látky: terbinafin způsobil akumulaci squalenu, flukonazol lanosterolu, což odpovídá inhibici ERG1 a ERG11.
• Potenciální inhibitory: NCE 1181-0519 vedl k nárůstu 4,4-dimethyl-8,24-cholestadienolu (cílový enzym ERG25). Totarol způsobil dramatickou akumulaci 4α-carboxy-4β-methyl-5α-sterolu, potvrzující cíl ERG26.
• Untargeted analýzy objevily nové meziprodukty a nečekané steroly, potvrzené MS/MS a strukturální korelací.

Přínosy a praktické využití metody

Kombinace cílené a necílené GC/Q-TOF analýzy s multivariační statistikou umožňuje přesně stanovit enzimatické kroky ovlivněné léčivy. Vysoká citlivost a dynamický rozsah usnadňují detekci stopových metabolitů a identifikaci nových struktur.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další metabolické dráhy a patologické organismy.
• Integrace s genomickými a proteomickými daty pro holistický pohled.
• Vývoj nových bioinformatických nástrojů pro rychlejší strukturální identifikaci.

Závěr

Metabolické profilování sterolů u kvasinek pomocí vysokorychlostní GC/Q-TOF nabízí robustní přístup pro odhalení cílů antifungálních látek. Studie potvrdila známé mechanismy i objevila nové akumulované meziprodukty, což podporuje vývoj specifických inhibitorů dráhy ergosterolu.

Reference

• Giaever G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 793–798 (2004).
• Folch J. et al., J Biol Chem, 226, 497–509 (1957).