Myth Busters: The Truth About Metabolomics and High Resolution Gas Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry

Význam tématu

Metabolomika představuje klíčovou oblast biochemického výzkumu zaměřenou na komplexní profilování malých molekul v biologických vzorcích. Správná identifikace a kvantifikace metabolitů jsou zásadní pro porozumění metabolickým drahám, diagnostiku onemocnění a vývoj nových terapeutik. Vysoce citlivá a selektivní analytická technika GC-HRT (plynová chromatografie vysokého rozlišení v kombinaci s TOF hmotnostní spektrometrií) nabízí v metabolomice jedinečnou schopnost zachytit široké spektrum látek s vysokou hmotnostní přesností a rozlišovací schopností.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentace bylo vyvrátit běžné mýty týkající se využitelnosti GC-MS ve metabolomických studiích. Autoři identifikovali šest hlavních předsudků o omezené použitelnosti GC-MS a ukázali, jak moderní GC-HRT překonává tyto bariéry. Ukázali příklady analýz lidské plazmy, séra i rostlinných extraktů a demonstrovali schopnost techniky zachytit polaritu, derivatizační produkty i vyšší molekulové hmotnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (např. lidské sérum, plazma, kukuřičný extrakt) byly připraveny standardním protokolem derivatizace: nejprve MEOX (25 µl, 60 °C, 1 h), poté MSTFA (75 µl, 60 °C, 1 h). Suchý zbytek se lyofilizoval a poté analyzoval.

• Chromatograf: Agilent 7890 GC s Gerstel MPS autosamplerem
• Kolona: Restek Rxi-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm)
• Carrier gas: helium 1,0 ml/min
• Program teploty: 70 °C (2 min) → 280 °C při 20 °C/min (3 min)
• Injektáž: 1 µl, split 10:1
• MS: LECO Pegasus® GC-HRT, EI 70 eV (35–510 m/z), CI 140 eV (60–1000 m/z)
• Rozlišení: až 30 000–50 000, 12 spekter/s, interní kalibrace PFTBA
• HRD™ dekonvoluce spekter

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala spolehlivou detekci více než stovky metabolitů včetně aminokyselin, organických kyselin, sacharidů, mastných kyselin, sterolů a alkaloidů. Všechny stanovené složky vykázaly hmotnostní přesnost pod 1 ppm. HRD™ dekonvoluce umožnila rozlišení izobarických složek a přiřazení fragmentů. Příklady: lactát, alanin, pyruvát, cholesterol, glukóza 5TMS, aminokyseliny 2–4TMS.
Diskuse se zaměřila na překonání následujících mýtů:

• GC-MS je vhodné i pro polaritu a vyšší molekulové hmotnosti při použití derivatizace a CI režimu
• Derivatizace je rutinní, zvyšuje citlivost i selektivitu
• Vysoké m/z nad 400 lze analyzovat díky CI-HRT
• Fragmentace EI v kombinaci s přesnou hmotností poskytuje robustní strukturní informace
• HR-MS eliminuje potřebu doplňujících MS/MS experimentů pro základní identifikaci

Přínosy a praktické využití metody

GC-HRT spojuje výhody GC-MS (vysoká chromatografická separace a rozlišitelnost derivatizačních produktů) s vysokou hmotnostní přesností a rozlišením TOF analyzátoru. Díky tomu je možné:

• Komplexní profilování metabolitů v biologických matricích
• Vysoce přesná identifikace a kvantifikace (hmotnostní chyba <1 ppm)
• Rozlišení izobarických a blízkých m/z signálů
• Vyhledávání v rozsáhlých knihovnách (NIST, Wiley)
• Strukturní charakterizace fragmentů a aduktů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj v oblasti automatizace derivatizace, nasazení AI algoritmů pro dekonvoluci a interpretaci dat a rozšíření databází spekter. Dále pravděpodobně poroste integrace GC-HRT s dalšími analytickými technikami (LC-MS, NMR) v rámci multi-omics přístupů. Vývoj nové generace reaktivních činidel pro derivatizaci může dále zlepšit citlivost a rozsah detekovaných metabolitů.

Závěr

Prezentovaná data jednoznačně ukazují, že moderní GC-HRT je výkonným a nepostradatelným nástrojem metabolomických studií. Nabízí široké pokrytí analytů, vysokou hmotnostní přesnost, rozlišení a robustnost, což umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci v komplexních biologických vzorcích.

Reference

V prezentaci nebyly uvedeny explicitní literární odkazy.