Česká chromatografická škola - HPLC.cz 2021 - Den 2

Zahajující, plenární přednáška se podívala k samotným kořenům a prvním zmínkám a pokusům o separaci látek pomocí chromatografických technik. Od té doby se tato základní technika v analytické chemii posunula o nepředstavitelný kus dál a rozšířila o mnoho technických provedení. Všechny ale mají společný cíl - dělit, rozdělit, rozseparovat směsi látek a dopravit analyty k nejrůznějším detektorům, které dnes máme k dispozici.

Pvní sekce konference byla věnována vzpomínce na velkou osobnost nejen české, ale také světové kapalinové chromatografie. Prof. Pavel Jandera nás před pár týdny opustil a jeho žáci a později kolegové nám pana profesora přiblížili ve svých osobních vzpomínkách a zážitcích, které s ním za ty roky zažili.

Dále následovali odborné přednášky, příspěvky a novinky výrobců instrumentace a spotřebního materiálů a během přestávek nejrůznější diskuse např. v posterové sekci.

Den byl slavnostně a stylově ukončen křestem jedinečné české publikace „MODERNÍ HPLC SEPARACE V TEORII A PRAXI“.

• První díl učebnice je rozčleněn do 5 hlavních kapitol, které jsou zaměřeny na teoretické aspekty HPLC a vzájemně se tematicky prolínají.
• Druhý díl se zabývá praktickou částí HPLC, jmenovitě laboratorní praxí v oblasti HPLC, vývojem a optimalizací metody, přípravou vzorku k chromatografické analýze, vyhodnocováním výsledků, validací metod, kvalifikací HPLC systémů a řešením problémů v HPLC.

Každý účastník, který si tyto knihy na místě zakoupil, si mohl nechat knihy od autorů podepsat a pokud měl štěstí, získal také jedinečné osobní věnování, které tak dělají z jeho výtisků unikát.

Kompletní program včetně abstraktů k jednotlivým přednáškám naleznete na webu konference a také níže

Pondělí 20. 09. 2021

PLENÁRNÍ PŘEDNÁŠKA

• 09:00 – 09:45 Vývoj HPLC v čase: od průlomových myšlenek k současným trendům (P. Česla)

Vývoj HPLC v čase: od průlomových myšlenek k současným trendům (P. Česla)

Almost seventy years have passed from the discovery of chromatography in 1903 to the introduction of the HPLC technique in 1967 (1,2), during which time the physicochemical basis of chromatographic separation of substances has largely been investigated. Already during this period, i.e. the nomenclature of the new analytical branch was formed, the mechanisms of retention of substances, and the kinetic processes counteracting separation were thoroughly described (3,4). The subsequent spread of HPLC techniques to the analytical laboratories worldwide was related to the wider availability of commercial instrumentation, increasing column separation efficiency and improved detection capabilities of the analytes. Future trends can be traced in the literature published during the pioneering days of chromatography development (5), which are reflected in current advances in ultrahigh performance liquid chromatography, the use of superficially porous particles in the columns, and the multidimensional liquid chromatographic separations. These concepts are described and discussed with respect to the historical perspectives together with the advances versus limitations of its application.

1. UCTĚNÍ PAMÁTKY PROF. JANDERY (předseda sekce: P. Česla)

• 09:45 – 09:55 Vzpomínka na prof. Pavla Janderu (P. Česla, J. Urban)

• 09:55 – 10:25 Možnosti optimalizace gradientové eluce (J. Urban)

Možnosti optimalizace gradientové eluce (J. Urban)

Reversed-phase liquid chromatography is one of the most common retention mechanisms applied in separation sciences. On the other hand, it might show difficulties separating very polar compounds with limited retention that usually elute near the column hold up volume. Optimizing isocratic mobile phase composition for low-retention compounds causes unprecedented analysis time extension as less polar compounds provide significantly higher retention and elute later. Therefore, gradient elution liquid chromatography with a variable mobile phase composition through the analysis is a method of choice in the separation of samples with analytes differing in polarity.

Compared to isocratic elution, optimizing gradient elution is a more complex process focusing on selecting an overall gradient time and the initial and final concentration of organic fraction in the mobile phase. Various experimental protocols are used to find optimal elution conditions. Besides the try-and-error method that is the most time-consuming and less informative, retention modeling and design-of-experiments approaches are being used to optimize the gradient elution method.

Retention modeling allows a description of the retention behavior of analytes in the separation system and a prediction of retention times and peak bandwidths in experimental conditions that were not determined experimentally. Thus, a utilization of a proper retention model significantly decreases method development time, as usually only several gradient runs are necessary to describe separation space fully.

In the design-of-experiments approach, the experiments are planned to cover selected variables systematically. For example, for three experimental variables, each defined by the lowest, the middle, and the highest value, only fifteen experimental runs, including twelve design runs and three repetitive design center runs, are necessary. Then, a mathematical model is fitted through individual experiments to fill in chromatographic information and to uncover variables that are statistically in/significant.

The presentation starts with the description of the retention behavior of polar dopamine-related compounds in isocratic liquid chromatography. Then, optimization of gradient shape is discussed utilizing input data from both isocratic and gradient elution. Finally, an optimization of a selected chromatographic variable by the design-of-experiments approach is discussed. The presentation's main aim is to provide the audience with simple and easy-to-use optimization protocols allowing optimization of gradient separation by using conventional spreadsheet software.

• 10:25 – 10:55 Na co se do budoucna těšit v chromatografii? (F. Švec)

Na co se do budoucna těšit v chromatografii? (F. Švec)

Od doby pionýrské práce M. Cvěta vynálezce chromatografie uplynulo zhruba 120 let. Za tuto dobu tato technika prošla neuvěřitelným vývojem a stala se třetí nejčastěji používanou metodou analytické chemie hned po vážení a měření pH. Přesto, nelze její vývoj považovat za skončený, neboť požadavky na tuto analytickou metodu neustále rostou. Čeho bychom chtěli v kapalinové chromatografii dosáhnout? Rychlých, vysoce účinných separací vyznačujících se velkou píkovou kapacitou. Vývoje kolon se značně zlepšenou selektivitou. Velikost kolon je třeba minimalizovat tak, aby umožnily separace velmi malých vzorků při omezené spotřebě, pokud možno „zelené“ mobilní fáze. Tato prezentace představí na konkrétních příkladech, jak se s těmito extrémními požadavky vypořádávají špičkoví světoví vědci ve výzkumu na jejich pracovištích. Na závěr budou uvedeny náměty pro další vývoj kapalinové chromatografie.

• 10:55 – 11:25 Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

Přednáška generálního sponzora

• 11:25 – 11:40 Demonstrace moderních separačních technik (L. Plaček, Pragolab)

Demonstrace moderních separačních technik (L. Plaček, Pragolab)

Vanquish Neo, krasavec, který doplňuje řadu UHPLC Vanquish o nízko-průtokové UHPLC, který zvládne průtoky od 1 nl/min do 100 ul/min s minimalizací mimo kolonových příspěvků bez jakéhokoliv hardwarového přestavení.

Nízko-průtokové UHPLC se s oblibou používají při proteomických, metabolomických a lipidomických studiích, kde hraje roli množství vzorku a nutnost sensitivní analýzy. S klesajícím průtokem mobilní fáze s analyty dochází v nano-elektrospreji k významnému navýšení výtěžnosti ionizace a tím i vlastní odezvy hmotnostně spektrometrické detekce. Vanquish Neo se stává volbou číslo jedna tam, kde chceme použít průměr kolon menší než 1 mm.

2. ANALÝZA ROSTLINNÝCH MATERIÁLŮ (předseda sekce: L. Nováková)

• 11:40 – 12:10 Moderní analýza rostlinných materiálů (P. Bednář)

Moderní analýza rostlinných materiálů (P. Bednář)

Mass spectrometry-based metabolomics is being increasingly utilized in various research fields including plant/natural products studies. Untargeted analysis of metabolites utilizing either direct mass spectrometry or its combination with chromatographic separation (first of all LC/MS) provides large amount of information when biomarker discovery is the main goal (1). This communication deals with investigation of seed coat composition with respect to legume seed dormancy/domestication. Flow-injection electrospray ionization mass spectrometry in combination with multivariate statistical analysis allows to classify pea seeds according to their developmental stage and dormancy level and revealed compounds significantly changed during seed maturation and with respect to germination ability of studied genotypes. These biomarkers were studied in detail by a combination of liquid chromatography, ion mobility (using linear and cyclic IMS cells) and high resolution tandem mass spectrometry. Oligomers of gallocatechin belong among biomarkers of particular interest being tentatively put into context with polyphenoloxidase activity. Besides, combination of electronically driven micromanipulation with laser desorption-ionization imaging mass spectrometry allowed 3D metabolic profiling of hilum – a scar left on seed coat where seed was formerly attached to maternal plant (2).

• 12:10 – 12:40 Mikroextrakce na bázi disperzní SPE - inovativní řešení pro přípravu vzorků (O. Novák)

Mikroextrakce na bázi disperzní SPE - inovativní řešení pro přípravu vzorků (O. Novák)

Cytokinins and auxins are naturally occurring plant growth regulators. They play an important role in controlling the growth and developmental processes in plants. Similarly to other phytohormones, their concentrations in plant tissues are usually very low (pmol per gram of fresh weight). Therefore, their identification and quantification are based on highly sensitive analytical approaches, such as an ultra-high performance liquid chromatography combined with a tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Moreover, sample preparation, especially removal of salts and isolation of analytes from a complex plant matrix, is the most critical procedure for achieving high-quality data. For many years, the purification of cytokinins and auxins has been based on a well-established solid phase extraction (SPE). However, dispersive SPE (dSPE) was introduced a few years ago as an effective and robust approach to isolating a wide range of analytes. In the contrast with conventional SPEs, this technique uses free solid phase particles dispersed in a liquid crude sample extract. We tested micro-dSPE as an innovative, fast and cheap approach to the isolation of selected phytohormonal groups (cytokinins and auxins). Our work was mainly focused on the investigation of the main parameters contributing to the extraction efficiency in comparison with conventional SPE technology.

• 12:40 – 13:00 Separační metody jako nástroje rostlinné fyziologie, biochemie a hodnocení kvality rostlinné produkce (P. Tarkowski)

Separační metody jako nástroje rostlinné fyziologie, biochemie a hodnocení kvality rostlinné produkce (P. Tarkowski)

Separation methods are analytical tools indispensable in modern plant science research as well as quality assessment of food crops. Since plant tissue extracts represent complex multicomponent mixtures, sensitive, and sufficiently selective analytical methods are required for the determination of endogenous metabolites. Phytochemistry research groups at Palacky University and Crop Research Institute carry out chemical analyses of plants and plant products. They utilize various extraction and distillation methods to isolate primary and secondary metabolites, as well as elements. Molecular spectrometry, mass spectrometry with inductively coupled plasma, liquid chromatography, gas chromatography, capillary electrophoresis hyphenated with various detectors (UV/VIS, MS, FL, ELSD) are employed as methods of final analysis. These approaches allow us to obtain information on elements, small organic acid, amino acid, fatty acid, sugar, fructan, vitamin, terpenoid, phenolic, glucosinolate, cannabinoid, polyamine, cytokinin, and strigolactone content in relevant biological material. Data acquired might be used in fundamental research (plant biochemistry and physiology), quality assessments of genetic resources, and plant products in applied research or food production. The lecture is focused on HPLC/UHPLC separation of 2-MeS-cytokinins, quercetin and its conjugates, cannabinoids, amino acids, and sugars using Phenomenex chromatographic columns.

• 13:00 – 14:30 Oběd

Přednáška sponzora sekce

• 14:30 – 14:40 Nové/unikátní LC kolony z dílny Chromservis (J. Merhaut, Chromservis)

Nové/unikátní LC kolony z dílny Chromservis (L. Vlk, Chromservis)

3. KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA (předseda sekce: J. Urban)

• 14:40 – 15:10 Analýza a charakterizace antimikrobiálních peptidů kapilární elektroforézou a izotachoforézou (V. Kašička)

Analýza a charakterizace antimikrobiálních peptidů kapilární elektroforézou a izotachoforézou (V. Kašička)

Capillary zone electrophoresis (CZE) and capillary isotachophoresis (CITP) will be presented as high-performance separation methods for analysis and characterization of peptides (1). In this study, CZE and CITP were used for qualitative and quantitative analysis and for investigation of acid-base and electromigration properties of polycationic antimicrobial peptides (AMPs) isolated from the venom of two species of Hymenoptera insects (2, 3). These AMPs contain 10-20 amino acids (AAs), among others 3 to 7 basic AAs (His, Lys, and Arg).

Purity degree of synthetic AMPs was assessed by CZE in acidic background electrolytes (BGEs) using fused silica capillaries coated with cationic surfactants or polymers suppressing adsorption of AMPs on the capillary wall. Content of counterions of AMPs was determined by CITP.

Acid-base and electromigration properties of AMPs were evaluated using a combination of CZE and CITP methods (4, 5). First, the dependences of the effective mobilities of AMPs on pH were measured in a series of BGEs within a wide pH range 1.80–12.1, at constant ionic strength of 25 mM, and at constant temperature of 25°C. From these dependences, the mixed acidity constants, pKa,mix, and the actual ionic mobilities of AMPs were determined by the nonlinear regression analysis. Subsequently, the pKa,mix values were recalculated to the thermodynamic acidity constants, pKa,th, using the Debye-Hückel theory as shown in (6). The pKa,th of His was in the range 3.72-4.98, the pKa,th of α-amino group of N-terminal AAs was in the range 6.14-6.93, and the pKa,th of ε-amino group of Lys spanned the interval 7.26-9.84. The pKa,th of Arg was greater than 12 and could not be directly measured.

The effective charge of the AMPs was determined by CITP based on linear dependence of the CITP zone length of the analyte on its effective charge and injected substance amount. Cationic CITP system with leading electrolyte composed of 10 mM ammonium leading ion, 40 mM acetate counterion, pH 4.1, and terminating electrolyte containing 40 mM acetic acid, pH 3.2, provided sharply separated AMPs zones with good linearity and repeatability of their lengths. The effective charges of the AMPs were found to be in the range 1.65-5.04, i.e. significantly smaller than the theoretical effective charges (2.86-6.99) calculated from the pKa,mix values. CZE and CITP proved to be effective methods for analysis and physicochemical characterization of polycationic antimicrobial peptides in a microscale.

• 15:10 – 15:30 Kapilární elektroforéza ve spojení s hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem pro analýzu derivátů oxaliplatiny (J. Petr)

Capillary electrophoresis (CE) hyphenated to inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) represents an interesting and beneficial tool for many applications. Nowadays, CE-ICP-MS is used primarily for determination of metals, speciation analysis, and metal-ligand interaction studies, including metal-based nanoparticles, as recently reviewed (1). However, CE-ICP-MS has a huge potential to affect also other fields by taking account of other advantages of CE, e.g., in chiral separations or by using online preconcentration methodologies. In this communication, our “in-house” CE-ICP-MS interface will be presented in two applications: (i) separation of oxaliplatin enantiomers (2), and (ii) determination of B and C pharmacopeia oxaliplatin impurities using sweeping online preconcentration (3). The separation of (R,R)- and (S,S)-oxaliplatin was conducted in 40 mM borate buffer pH 9.5 with 60 mg/mL sulfated-β-cyclodextrin. LOD was 64 ng/mL determined from the 195Pt isotope signal. The determination of oxaliplatin impurities was done at 25 mM phosphate buffer pH 2.15 with 175 mM SDS. With the injection time of 90 s, LODs ranged from 1 to 3 ng/mL. Hence, we believe CE-ICP-MS represents interesting avenues for the future research.

• 15:30 – 15:50 Kapilární elektroforéza jako všestranný nástroj pro analýzu chladicích kapalin (T. Křížek)

Coolants are routinely used across practically all fields of industry. Their lifetime is naturally limited, which leads to the production of immense amounts of waste that should be recycled. Several approaches to recycling spent coolants have been proposed and published (1, 2). Despite that, only a negligible part of industrial coolants is recycled in reality. The main reason is the high energetic demand of most of the processes. Electrodialysis seems to be a promising technology (3) that could change the current situation as it fulfills both, environmental as well as economic criteria. Nevertheless, the introduction of a recycling line into practical use is a complex process that requires quality control of the spent coolant entering the recycling line as well as the recycled material.

Capillary electrophoresis offers fast separations and outstanding flexibility enabling simple and inexpensive exchange of whole separation environment as well as detection approach. Several analytical methods can thus be run on a single instrument in quick succession. This lecture shows the application of capillary electrophoresis in the analysis of engine coolants before and after their electrodialysis-based recycling. Aryltriazoles, ethanolamines, inorganic anions, organic acids, and denatonium benzoate are determined. As the individual groups of analytes differ in their properties, different approaches and techniques are used including direct UV detection for UV-absorbing analytes, indirect UV detection for non-absorbing ones, reversal of electroosmotic flow for anionic analytes, and field-amplified sample injection for enhanced detection of at low concentration levels. The resulting set of methods presents a fast and simple solution as all separations take up to 5 minutes and sample treatment consists of filtration and dilution only.

• 15:50 – 16:20 Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

Přednáška sponzora sekce

• 16:20 – 16:30 Nová LC 300 PerkinElmer (P. Šmejda, PE Systems)

Nová LC 300 PerkinElmer (P. Šmejda, PE Systems)

4. PRAKTICKÁ HPLC (předseda sekce: V. Kašička)

• 16:30 – 17:00 Alternativní řešení problémů v HPLC (J. Hlaváč)

Alternativní řešení problémů v HPLC (J. Hlaváč)

Alternativní analytická chemie je oblast vědy, která hledá netradiční, jednoduchá řešení problémů tam, kde je klasická analytická chemie limitována konvencemi zavedenými v průběhu jejího používání. Díky systematickému vyvracení mýtů o nutnosti dodržování zavedených dogmat v oblasti separačních metod se v minulosti podařilo vyvinout např. extrakritickou fluidní chromatografii jako účinnější alternativu původně tolik nadějné superkritické fluidní chromatografie.

V této přednášce bude pozornost věnována některým problémům, které tradiční analytická chemie dosud vyřešit neumí. Mezi ně patří např. zvýšení účinnosti chromatografické kolony na nekonečno či povýšení životnosti kolony nad životnost operátora. Tyto a některé další problémy spojené s používáním chromatografických metod budou v přednášce diskutovány a posluchači budou seznámeni s výsledky hledání alternativních způsobů jejich řešení.

• 17:00 – 17:20 In vino veritas – elektrochemicky detekovatelné antioxidanty ve víně, ovoci a lidské moči (A. Horna)

In vino veritas – elektrochemicky detekovatelné antioxidanty ve víně, ovoci a lidské moči (A. Horna)

We had been dealing with application of RP- HPLC with electrochemical CoulArray detection to the analysis of 32 natural antioxidants in beer, wine, tea and plant extracts (1) . Recently, because of the need to analyse hundreds of samples of various fruit we started to use 4 channel CoulArray as a detector in flow injection analysis. The time of the analysis was reduced to 66 s. FIA/ CoulArray seems to very useful tool in the evaluation of antioxidant activity of wine, fruit, plant extracts and also human plasma and urine for better understanding of targeted nutritional therapy in human health.

• 17:20 – 17:50 KŘEST KNIHY „MODERNÍ HPLC SEPARACE V TEORII A PRAXI“ (L. Nováková, M. Douša)

Křest české publikace „MODERNÍ HPLC SEPARACE V TEORII A PRAXI“

• 19:00 Večeře, cimbálová muzika Primáš