Vitatox 2021 - Den 2

První blok přednášek zahájili prezentace dodavatelů analytické instrumentace k možnostem jejich kapalinových chromatografů (HPLC) a jejich spojení s hmotnostními spektrometry (LC/MS) například pro cílený screening pro rychlejší a jistější získávání výsledků. Následovali odborné přednášky k použití moderních spektroskopických a separačních technik při komplexní analýze padělků léčiv a způsobu monitorování residuí léčiv pomocí LC-MS/MS v povrchových vodách.

Druhý blok nám ukázal možnosti analýz suché kapky krve a stanovení kyseliny močové a alantoinu a dozvěděli jsme se více také o analýze fytokanabinoidů v různých komerčních produktech. Další přednáška diskutovala různé skenovací režimy orbitálních pastí na metabolitu JWH-018 s cílem dosažení minimálních LOD a LOQ v bioanalýze syntetických kannabinoidů. Poslední přednáška bloku prakticky ukázala způsoby vyhledávání informací a filtrování v aplikacích, webinářích, novinkách a dalším obsahu na portálech LabRulez.

Poslední úterní odborný blok byl věnován monitoringu terapeutických léčiv (TDM) jako jsou antibiotika pomocí LC-MS, zkušenosti s TDM pro Infliximab a Adalimumab nebo komplexní problematiku stanovení gancikloviru v séru. Závěrečná přednáška nám ukázala zákulisí a přiblížila problematiku a také historii testovaní SARS-CoV-2 v ČR z pohledu komerčních laboratoří.

Kapalinová chromatografie Shimadzu

• Mgr. Ondřej Hilmich, SHIMADZU Handels

Shimadzu kapalinová chromatografie prošla za poslední 3 roky absolutní obměnou všech svých modelů. V těchto 3 letech stačilo Shimadzu představit jak nové analytické kapalinové chromatografy, tak také preparativní. To nyní Shimadzu řadí mezi nejmodernější a nejvíce technologicky vyspělé chromatografy na trhu.

Vitatox 2021: Kapalinová chromatografie Shimadzu (Mgr. Ondřej Hilmich, SHIMADZU Handels)

Kromě robustního a spolehlivého hardwaru Shimadzu zapracovalo také na softwarových pomůckách např. oblasti „analytické intelegence“.

Nechte se překvapit, co vše již v dnešní době kapalinové chromatografy umí.

Next level of targeted screening, which way to go: faster analysis or more certainty in the results

• Ing. Daniel Vláčil, Bruker

Modern LC-mass spectrometers are much more sensitive and faster than in the past. Times, when only triple quadrupole systems could quantify, are from the past. Now we are facing new developments, more sensitivity, even higher scan rates, and the development of proper Ion Mobility separation. How to make the best use of this new technology in screening application in different application areas. Sometimes it is best to use these new tools to increase more trust in the final results, sometimes to use it to get an even broader or faster screening. The aim of the presentation is to give highlights on the new possibilities and discuss the usage of them in different analytical areas. Also, non-targeted screening is getting more possibilities by using the new systems.

Odhalování padělků léčivých přípravků kombinací spektroskopických a separačních technik

• doc. Ing. Martin Kuchař, Ph.D., Vysoká škola chemicko-technologická

Padělky léčivých přípravků představují závažný společenský problém s dopadem na zdraví uživatelů léčiv – pacientů, ale i zdravé populace, která si stále častěji objednává podpůrné léky přes internetové lékárny. Odhalování padělaných léčivých přípravků představuje výzvu nejen pro orgány činné v trestním řízení, ale především pro analytické laboratoře, které se musí vypořádat s řadou nástrah v podobě komplikované matrice, chybějících komerčně dostupných analytických standardů a také velmi zdařilých padělků léčiv, které obsahují aktivní látku v deklarovaném množství a jsou téměř k nerozeznání od originálního léčiva.

Vitatox 2021: Odhalování padělků léčivých přípravků kombinací spektroskopických a separačních technik (doc. Ing. Martin Kuchař, Ph.D., VŠCHT)

Vedle stanovení aktivní látky, kterou výrobci v přípravku deklarují, je klíčové hledání dalších biologicky aktivních látek a látek pomocných, které mohou představovat marker padělaného léčiva. V případě velmi zdařilých padělků, které obsahují aktivní látky ve stejné koncentraci jako originální léčivo, přichází na řadu kombinace několika analytických metod.

V této práci byla zvolena v případě padělků přípravků na léčbu erektilní disfunkce Ramanova spektroskopie a rentgenová prášková difrakce. V případě padělků látek ze skupiny benzodiazepinů byla s výhodou využita kombinace rentgenová prášková difrakce a kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií.

Monitoring a výskyt reziduí vybraných léčiv v povrchových vodách pomocí LC-MS/MS

• Ing. Martin Ferenčík, Povodí Labe

Kvalita povrchových vod je negativně ovlivněna přítomností řady antropogenních kontaminantů. Mezi nimi rezidua léčiv spolu s pesticidy představují nejčastěji nalézané kontaminanty v řádu nanogramů až mikrogramů na litr (1-5). Kontinuálním zdrojem léčiv a jejich metabolitů jsou především výtoky z komunálních čistíren odpadních vod (ČOV), případně z domácích čistíren. Přestože mnohé účinné látky léčiv se intenzivně odbourávají během čistírenského procesu, jsme schopni zachytit jejich přítomnost pomocí citlivé analytické techniky kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií s elektrospejovou ionizací (LC-ESI-MS/MS).

Mezi nejčastěji nalézané léčiva patří ty nejčastěji používané, případně nejstabilnější, jako například acetaminofen (paracetamol, antipyretikum a analgetikum), diklofenak a ibuprofen (nesteroidní protizánětlivé látky, NSAID, antiflogistikum, analgetikum a antipyretikum), antiepileptika gabapentin a karbamazepin, antidiabetikum metformin, kardiovaskulární léčiva na bázi beta-blokátorů (atenolol, metoprolol), opiáty proti bolesti (tramadol), antibiotika (makrolidové klarithromycin), chemoterapeutikum sulfamethoxazol, diuretikum hydrochlorothiazid, rentgenokontrastní látky iomeprol a iopromid, atd.

Léčiva přítomná v povrchových zdrojích surových pitných vod lze účinně odstranit pokročilými vodárenskými technologiemi např. na bázi ozonizace, UV záření, adsorpce na aktivním uhlí a jejich kombinacemi.

Screeningová metoda pro simultánní stanovení kyseliny močové a alantoinu v krvi získané technikou suché kapky

• prof. Mgr. Roman Kanďár, Ph.D., Univerzita Pardubice

Kyselina močová a její produkt oxidace, alantoin, mohou být vhodnými ukazateli oxidačního stresu u lidí. V současné době jsou kladeny vysoké požadavky nejen na testy pro monitorování oxidačního stresu, ale obecně na screeningové laboratorní testy. Nejvíce je kladen důraz na co nejjednodušší odběr vzorku, snadný transport vzorku do laboratoře a co nejkratší dobu analýzy.

Vyvinuli jsme relativně rychlou, dostatečně citlivou a spolehlivou metodu HPLC-MS/MS pro simultánní stanovení hladin alantoinu a kyseliny močové v lidské krvi získané technikou suché kapky. Alantoin a kyselina močová byly separovány v systému obrácených fází během 3 minut. Příprava vzorku před vlastní analýzou byla jednoduchá, spočívala pouze v extrakci analytů 85% acetonitrilem.

Analytické parametry prezentované metody byly vyhovující, linearita byla dosažena v celém testovaném rozsahu (alantoin 0,5-50,0 μmol/l, R = 0,9996; kyselina močová 10-700 μmol/l, R = 0,9974), přesnost v sérii a mezi sériemi, vyjádřena variačním koeficientem, se pohybovala pod 5 %. Nejnižší koncentrací alantoinu a kyseliny močové, kterou bylo možné kvantifikovat s přijatelnou správností a přesností, byla 0,4 μmol/l a 9 μmol/l. Mez detekce byla vypočtena z kalibračních křivek jako 3,3×Sa/b, kde Sa je standardní odchylka úseku na ose y, b je směrnice kalibrační křivky) a byla 49 fmol/nástřik pro alantoin a 978 fmol/nástřik pro kyselinu močovou. Prezentovaná metoda byla použita pro stanovení hladin alantoinu a kyselinu močové v krvi 45 dobrovolných dárců.

Závěrem lze konstatovat, že metoda je vhodná pro screeningové stanovení hladin alantoinu a kyseliny močové v lidské krvi, získané technikou suché kapky, a monitorování oxidačního stresu.

Analýza fytokanabinoidů v komerčních produktech

• Ing. Magdaléna Vágnerová, Vysoká škola chemicko-technologická

Konopí seté je po staletí užíváno pro své léčivé i psychoaktivní účinky, rostoucí oblibě se však těší také volně prodejné konopné přípravky. Jedná se o širokou škálu produktů, zahrnujících doplňky stravy, kosmetiku (masti, krémy) a konopné potraviny. Jejich hlavní složkou je nejčastěji kanabidiol (CBD), nepsychoaktivní kanabinoid, kterému jsou připisovány analgetické a protizánětlivé účinky. Jeho obsah v konopných produktech tak mnohonásobně převyšuje ostatní kanabinoidy, jako např. psychoaktivní tetrahydrokanabinol (THC), jehož obsah musí být stanoven před uvedením výrobku na trh.

Široká škála produktů a velké rozmezí koncentrací kanabinoidů představuje výzvu pro analytické laboratoře. Tato práce se zabývá využitím kapalinové chromatografie s UV a hmotnostně-spektrometrickou detekcí pro analýzu konopných olejů, extraktů a kosmetiky. Pro přípravu vzorků před analýzou byla hodnocena metoda prostého ředění, která byla optimalizována pro každý typ konopného produktu. Po chromatografické separaci na reverzní fázi následovala detekce pomocí kombinace dvou detektorů s různým rozsahem citlivostí. Robustní UV detektor byl využit pro stanovení vysokých obsahů CBD a citlivější hmotnostní spektrometr byl zapojen pro detekci až 10 000× nižších obsahů THC, to vše v rámci jedné chromatografické metody. Po validaci byla metoda použita pro hodnocení obsahu kanabinoidů v reálných produktech.

Využití různých skenovacích režimů orbitální pasti na modelovém metabolitu JWH-018 k dosažení minimálních LOD a LOQ v problematice bioanalýzy syntetických kannabinoidů

• PharmDr. Viktor Voříšek, FAKULTNÍ NEMOCNICE V HRADCI KRÁLOVÉ, RADANAL

JWH-018 je historicky první syntetický kannabinoid s přímým a kvantitativně jasně měřitelným účinkem na endokannabinoidní systém vyvinutý skupinou soustředěnou kolem profesora Johna Williama Huffmana (Clemson University). Jeho jmenné inicály tvoří označení všech cca 400 struktur této skupiny. V době předkládané studie jsme měli k dispozici jeho derivát N-(4-hydroxy-pentyl) a značený analog indol-D5.

Na této vybrané modelové látce jsme vyzkoušeli obě základní skenovací možnosti ( parallel reaction monitoring, PRM – sken vybraných klíčových iontů po fragmentaci celé molekuly – vedle tzv.plného skenu, full scan), které nabízí systém Q Exactive Focus ( Thermo Fisher Scientific) k dosažení maximálních LOD a LOQ.

Zároveň jsme porovnali separační účinnost tří kolon: Phenyl Hexyl Kinetex®, Luna Omega® Polar C18 a ARION® Polar C18 UHPLC. Všechna stanovení byla prováděna v dubletech až tripletech.

Portály LabRulez - jak pracovat a vyhledávat v databázích LC, GC a MS aplikací, webinářů nebo přístrojů

• Ing. Ivo Novotný, LabRulez

Portály LabRulez jsou unikátním globálním konceptem zaměřeným na rychlý, jednoduchý a efektivní přístup k informacím především z oblasti analytické chemie. Nejmodernější IT technologie tak návštěvníkům umožňují na jednom místě prohledávat, filtrovat, a především najít informace, které by jinak bylo časově náročné a někdy i nemožné dohledat.

Množství informací na portálech, které jsou logicky a z důvodu přehlednosti odborně rozděleny na oblast kapalinové chromatografie www.lcms.cz a plynové chromatografie www.gcms.cz, roste každým dnem a společně se podíváme, jak s těmito informacemi pracovat a vyhledávat v nich.

Na portálech dnes najdete přes 14 000, především komerčních aplikací, technických článků, prezentací nebo manuálů, které na rozdíl od vědeckých článků, obsahují konkrétní a praktické informace především pro rutinní analýzy. Sekce webinářů je studnicí znalostí s více než 1 000 LC, GC nebo MS záznamy přednášek od zkušených specialistů. V neposlední řadě je tu sekce s přehledem instrumentace, spotřebního materiálu, společností v oboru nebo novinek v oboru, či nabídek práce.

Díky mnoha užitečným filtrům a pokročilým algoritmům vyhledávání je pak otázkou sekund dohledat to, co Vás zajímá.

Ať jste již firma nebo laboratoř, můžete si u nás vytvořit profil a stát se součástí komunity analytických chemiků na portálech LabRulez.

Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of Antibiotics by LC-MS

• Martin Knirsch, RECIPE Chemicals + Instruments

The benefit of TDM of antibiotics has long been controversially discussed. For a long time, the application was only recommended for a few antibiotics (e. g. aminoglycosides) in order to avoid the toxic side effects of overdosing. However, during the last decade, this attitude has undergone a signif-icant change due mainly to the widely increasing occurrences of antibiotic resistance. As insufficient antibiotic therapy may promote the occurrence of drug resistance, the “one-dose-fits-all” principle, especially for critically ill patients, is no longer considered to be up to date. Recent studies stated that a substantial proportion of intensive care unit (ICU) patients with insufficiently low antibiotic levels, have a higher mortality rate and suffer from greater infection severity.

Vitatox 2021: Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of Antibiotics by LC-MS (Martin Knirsch, RECIPE Chemicals + Instruments)

RECIPE has developed a simple, one-step LC MS/MS assay for the simultaneous determination of Antiobiotics in plasma and serum that is based on the universal TDM Platform. Only 50 μL of blood is needed. For accurate and precise quantitation, the kit includes a multi-level whole-blood calibrator. Matrix effects are compensated using stable isotope labeled internal standards.

RECIPE’s fully validated and CE IVD certified ClinMass® Kit enables the fast, easy and reliable determination of 15 Antibiotics one run.

Naše zkušenosti s TDM Infliximabu a Adalimumabu

• Mgr. Kristýna Vlková, Laboratoře AGEL

Crohnova nemoc a ulcerózní kolitida jsou onemocnění, která řadíme mezi idiopatické střevní záněty (inflammatory bowel disease-IBD). Přestože nemáme k dispozici kauzální terapii, léčba zánětlivých onemocnění se za poslední desetiletí významně vyvinula a dostupnost nových biologických terapií (infliximab, adalimumab, a další) vedle imunomodulační terapie zlepšila schopnost dosáhnout klinické a endoskopické remise.

Spolu s včasnou a účinnou léčbou je také důležité terapeutické monitorování léčiv (TDM). Existuje-li definovatelný vztah mezi koncentrací léčiva a klinickým účinkem, lze pravidelným monitorováním hladin léčiv a protilátek předpovídat odpověď pacienta a maximalizovat individualizovaný terapeutický přínos.

V současné době využíváme dvou farmakokinetických přístupů TDM a to tzv. reaktivního TDM, kdy měříme hladinu biologika s případnou detekcí protilátek proti němu v situaci, kdy dochází k selhávání terapie nebo výskytu nežádoucí reakce pacienta na léčbu a proaktivního TDM, kdy stanovujeme hladinu léku s protilátkami v klinické remisi s cílem ji udržet a zabránit případnému selhání léčby. Pro účely TDM se stanovuje nejnižší sérová hladina léčiva před podáním další dávky (tzv. trough level). Nízká hladina může indikovat nedostačující dávkování biologické léčby nebo tvorbu protilátek proti dané terapii. Výskyt protilátek může být transientní nebo trvalý. Detekce protilátek v rozmezí dvou měsíců bývá spojována se ztrátou odpovědi pacienta na léčbu.

Stanovení gancikloviru v séru

• doc. Ing. Eva Klapková, Ph.D., 2. LF UK a FN Motol

Ganciklovir (GCV) je antivirotikum využívané k systémově léčbě a prevenci nákazy organismu DNA viry patřícími do čeledi herpesviridae. Konkrétně se jedná o viry herpes simplex typu 1 a 2 (HSV 1,2), lidský cytomegalovirus (dále CMV), virus Epstein-Baarové a virus varicella zoster. K závažným projevům onemocnění způsobených těmito viry dochází u pacientů s oslabením imunity zapříčiněným například chemoterapií při léčbě onkologických onemocnění, získanou imunodeficiencí při nákaze virem HIV či díky imunosupresivní terapii po transplantaci orgánů. Terapeutické monitorování hladin umožňuje úpravu dávkování a tím minimalizovat toxicitu léku. U toho léku je popisována vysoká inter- a intra-individuální variabilita.

Ke stanovení GCV byla vyvinuta LC-MS/MS metoda za použití ionizace elektrosprejem v pozitivním modu na systému Agilent 1290 Triple Quad 6470. Jako vnitřní standard byl použit isotopově značený ganciklovir-d5. Analýza byla prováděna na koloně Eclipse Plus C18 (1,8 μm, 3,0 x 50 mm) za použití gradientu mobilních fází (A – voda s pufrem (5 %), B – acetonitril s pufrem (5 %)). V mobilních fázích byl použit pufr obsahující kyselinu octovou (25 ml/l), octan amonný (5 g/l) a kyselinu trifluoroctovou (2 ml/l). Metoda byla úspěšně validována. K předúpravě vzorku byla použita pouze precipitace proteinů acetonitrilem, po centrifugaci byl vzorek dále naředěn 5% roztokem kyseliny trichloroctové.

Ze zákulisí testování přítomnosti SARS-CoV-2 v České republice

• Ing. Michal Pohludka, Ph.D. MBA LL.M., GeneSpector

Pandemie COVID-19 ovlivnila všechny aspekty života každého jednotlivce v celosvětové populaci. Jednotlivé země zavedly širokou škálu opatření ke zmírnění dopadů, aby kontrolovaly šíření infekce a zabránily přetížení národních zdravotnických systémů. Neschopnost předvídat rychlost změny výskytu infekcí COVID-19 ztěžovala schopnost účinně reagovat na krizi.

Preferovanou metodou testování infekce SARS-CoV-2 je test RT-PCR, kde se pozitivita testu určuje podle prahových hodnot cyklu (Ct). Hodnota Ct je definována jako počet cyklů PCR potřebných k tomu, aby fluorescenční signál přesáhl úroveň pozadí, a hodnoty Ct jsou nepřímo úměrné množství cílové nukleové kyseliny ve vzorku. V případě infekce SARS-CoV-2 je hodnota Ct semikvantitativním ukazatelem koncentrace SARS-CoV-2 RNA ve vzorku pacienta. Nízké hodnoty Ct ukazují na vysokou virovou nálož, akutní fázi infekce a potenciálně vysokou infekčnost. Vysoké hodnoty Ct jsou typické pro velmi ranou fázi infekce nebo rekonvalescenci. Hodnoty Ct tak mohou poskytnout informaci o fázi infekce jedince (časná, aktivní, rekonvalescentní) a mohou být ukazatelem závažnosti onemocnění a/nebo infekčnosti (1). Zatímco hodnoty Ct nejsou užitečné pro posouzení závažnosti onemocnění u jednotlivců (2), průměrné hodnoty Ct mohou být prediktivní, což může být užitečné na úrovni populace (3, 4).

V naší studii jsme analyzovali data ze 729 740 diagnostických testů, které byly provedeny u 539 202 jedinců v jednom centru v České republice od dubna 2020 do června 2021. Dále jsme analyzovali výsledky 166 964 testů, které byly provedeny u 51 500 jedinců v rámci povinného programu testování ve školách od března 2021 do června 2021. Zajímalo nás, jak hodnoty Ct korelují s epidemiologickými trendy v komunitě a aplikovanými zmírňujícími politikami, se zvláštním důrazem kladeným na jednotlivé demografické skupiny a vliv uzavření škol.