Head-space analýzy v pivovarské analytice

Head-space metoda ve spojení s plynovou chromatografií představuje postup pro stanovení těkavých látek. Nalezla široké uplatnění při analýze potravin včetně piva. Tato práce je zaměřena na využití této techniky v pivovarské analytice a jsou diskutovány výhody a nevýhody různého způsobu provedení – statická head-space (provedení s plynotěsnou stříkačkou nebo v uspořádání ventil a dávkovací smyčka) a dynamická head-space metoda (purge and trap).

1 ÚVOD

Head-space technika je základní a velmi často používaná technika pro stanovení těkavých látek. Je založena na rozdělení sledovaných analytů mezi netěkavou kapalnou nebo pevnou fází a parní fází nad kapalným nebo pevným vzorkem. Vzhledem k tomu, že parní fáze obsahuje obvykle podstatně méně látek než vlastní kapalný nebo pevný vzorek, jde o velmi šetrný postup, kterým se výrazným způsobem potlačuje zatížení chromatografického systému nežádoucími interferujícími nebo kontaminujícími látkami, což významně prodlužuje životnost kapilární kolony. Klíčovým faktorem ovlivňujícím účinnost head-space postupu je distribuční konstanta analytu mezi plynnou a kapalnou fází. Čím více je rovnováha posunuta k plynné fázi, tím s větší citlivostí bude látka stanovena.

Myšlenka analyzovat parní fázi nad kapalným nebo pevným vzorkem pochází ještě z doby před rozvojem plynové chromatografie. Snad první zmínka v odborné literatuře o analýze plynné fáze vytvořené nad kapalinou pochází z práce Harger, Bridwell a Raney z roku 1939, ve které se autoři pokoušeli stanovit obsah alkoholu ve vodných roztocích (Harger et al., 1939). První zpráva o spojení statické head-space a plynového chromatografu se datuje do roku 1958 (Bo-vin et al., 1958). Současný stav head-space techniky popisuje celá řada publikací, např. Kolb a Ettre, 2006, Snow a Slack, 2002, Kolb, 2000, Pawliszyn a Lord, 2010, Chaintreau, 2000, Dewulf, Van Langhove, 2002, Roose, Brinkham, 2005.

Head-space analýza může být prováděna dvěma způsoby. Pokud je vzorek v rovnovážném stavu s plynnou fází v uzavřeném prostoru, potom se tato metoda nazývá statická head-space. Pokud nosný plyn proudí nad hladinou vzorku nebo probublává vzorkem a extrahované těkavé látky se zachytávají v kryogenní nebo sorpční pasti, pak se tento postup označuje jako dynamická head-space, gas-phase stripping nebo purge-and-trap.

2 STATICKÁ HEAD-SPACE METODA

Při statickém head-space postupu se ustavuje rovnováha mezi těkavými látkami obsaženými ve vzorku a v parní fázi nad vzorkem v plynotěsně uzavřené vialce. Po určité době nutné k ustanovení rovnováhy je část plynné fáze odebrána z vialky a nastříknuta na kolonu plynového chromatografu. K podpoře vytěsnění látek z kapalného vzorku do parního prostoru (pro látky s nízkou distribuční konstantou, které z větší části zůstávají v kapalné fázi) je možno použít zvýšenou teplotu ekvilibrace nebo zvýšit iontovou sílu vzorku pomocí vysolení. Účinné je také míchání nebo třepání vzorku během ustavování rovnováhy.

Metoda statické head-space analýzy našla uplatnění při stanovování řady významných senzoricky aktivních látek v pivu a jeho meziproduktech a stala se součástí oficiálních metodik mezinárodních pivovarských institucí. Jedná se především o tyto látky – vicinální diketony (diacetyl a 2,3-pentandion), acetoin, dimethylsulfid a jeho prekurzory, acetaldehyd, ethyl-acetát, nižší alkoholy a estery (metodiky: EBC, 2005, An: 1996a-f, 1997a-d, 2005).

Dnes jsou na trhu automatické head-space dávkovače, které zaručují pro každý vzorek zachovat konstantní dobu temperace za přesně stanovené teploty, temperování dalšího vzorku v sekvenci během měření předcházejícího vzorku na plynovém chromatografu (tím se výrazně šetří čas a zvyšuje tak možné množství zpracovaných vzorků), inertnost systému, umožňují měnit objem parní fáze nastřikovaný na kolonu plynového chromatografu, umožňují třepaní vzorku během temperance a v neposlední řadě volit různé parametry head-space metody (např. teplota inkubace vzorku, ekvilibrační doba) při optimalizaci postupu (Kolb, Ettre, 2006).

Statické head-space systémy jsou dvojího typu – buď k dávkování používají plynotěsnou stříkačku, nebo ventilový systém s dávkovací smyčkou

2.1 Systém s plynotěsnou stříkačkou

Nespornou výhodou tohoto systému je skutečnost, že ho lze získat rychlou modifikací automatického dávkovače pro kapalné vzorky jednoduchou záměnou klasické dávkovací stříkačky za plynotěsnou stříkačku. Nicméně v tomto případě stříkačka ani vialka se vzorkem nejsou vyhřívány. Proto toto uspořádání není vhodné pro analýzu pevných vzorků nebo výše vroucích analytů. Dnes se však dodávají automatické dávkovače, které umožňují jak vyhřívání stříkačky, tak vzorku. Navíc je možné po nadávkování vzorku nastavit i dobu proplachu stříkačky inertním plynem, a tak v případě vzorku s vysokým obsahem stanovovaných analytů zamezit jejich přenosu mezi vzorky (Kolb, Ettre, 2006).

Na trhu jsou dostupné stříkačkové head-space dávkovače např. firem CTC (CombiPal), Thermo Scientific (TriPlus), HTA.

2.2 Ventilový systém s dávkovací smyčkou

Toto uspořádání se skládá z vícecestného ventilu, dávkovací smyčky obvykle o objemu 1 ml a propojovací kapiláry, která je zavedena do nástřikového prostoru plynového chromatografu. Analýza probíhá v několika krocích. Nejprve je vialka se vzorkem zahřívána po předem stanovenou dobu při určené teplotě. Poté je septum vialky propíchnuto jehlou a prostor vialky je natlakován inertním plynem. V dalším kroku se přepne ventil tak, že se dávkovací smyčka naplní párami head-space prostoru. Nato se ventil opět přepne, a to tak, aby se plyn z dávkovací smyčky vypláchnul do propojovací kapiláry a byl tak přenesen na chromatografickou kolonu (Kolb, Ettre, 2006).

Tento typ head-space dávkovačů dodávají např. firmy Agilent Technologies, Dani, Tekmar-Dohrmann.

Výhody a nevýhody obou výše uvedených systémů jsou uvedeny v tab. 1 (Pawliszyn, Lord, 2010).

Tab. 1 Porovnání statického head-space dávkovače vybaveného plynotěsnou stříkačkou a ventilového systému s dávkovací smyčkou

3 DYNAMICKÁ HEAD-SPACE METODA

Při použití postupu dynamického head-space dochází k probublávání inertního plynu vzorkem a vytěsněné těkavé látky se zachytávají v absorpční pasti. Poté je past prudce zahřáta a těkavé látky jsou tak uvolněny nebo desorbovány a naneseny na kolonu plynového chromatografu. V další fázi je past vyhřáta na ještě vyšší teplotu, než při které došlo k uvolnění sledovaných analytů, a tím se odstraní re-zidua látek a vlhkost. Systém je pak připraven pro další analýzu.

Tato technika je obecně citlivější než metoda statické head-space, protože probubláváním se podaří vytěsnit z matrice vzorku podstatně více analytů než u statického provedení. Na druhé straně zařízení pro dynamický head-space je komplikovanější a problémy může způsobovat i pěnění vzorku během probublávání. V pivovarské analytice se dynamický head-space obvykle nepoužívá jednak z důvodu problémů s pěněním piva a jednak stanovované látky se nacházejí v koncentracích, které lze bez problémů stanovit technikou statického head-space (Čulík et al., 1997).

Porovnání statického a dynamického head-space je uvedeno v tab. 2 (Pawliszyn, Lord (2010).

Tab. 2 Porovnání technik statického a dynamického head-space

4 KVANTIFIKACE PŘI HEAD-SPACEANALÝZE

4.1 Možné problémy

Nejčastější příčinou problémů spojených s kvantifikací je u head-space analýzy nebezpečí ztráty stanovovaných těkavých látek během manipulace se vzorkem. K problémům může dojít již při přípravě standardů. Při odběru vzorků je velmi důležité vzorkovnici naplnit až po okraj, vzorky skladovat v chladu, popřípadě, pokud je to možné, je zamrazit. K analýze vzorků by se mělo také přistoupit co nejdříve po odběru vzorku. Příprava kalibračních vzorků vyžaduje určitou zručnost a zkušenost a je nutno jí věnovat náležitou péči. Především je důležité po přenesení vzorku do head-space vialky ji neprodleně důkladně uzavřít vhodným víčkem se septem.

Nízká odezva nebo dokonce žádná odezva stanovovaných látek je často způsobena nesprávným uzavřením vialek. K uzavírání vialek víčkem se septem slouží speciální uzavírací kleště, které je zapotřebí mít dobře seřízené. Pozornost je nutné věnovat i volbě vhodných sept, aby nedocházelo k porušení těsnosti během inkubace vzorku při zvýšené teplotě.

Při používání automatických head-space dávkovačů je nutné dobře nastavit hloubku jehly tak, aby zcela propíchla septum a zároveň nezajížděla příliš hluboko a nehrozilo nasátí kapalné fáze vzorku (Pawliszyn, Lord, 2010).

4.2 Použití interního standardu

Interní standard je látka, která se přidává ve stejném množství do vzorků, slepých pokusů a kalibračních standardů. Tato látka se používá ke kalibraci vynesením závislosti poměru signálu stanovovaného analytu k signálu interního standardu jako funkci koncentrace analytů. Použitím vnitřního standardu se eliminují ztráty analytu během přípravy vzorku. Jako vnitřní standard se volí látka, která se vyznačuje podobnými fyzikálně chemickými vlastnostmi jako stanovované látky, ale při chromatografické separaci se sledovanými analyty neinterferuje. Vzhledem k možným komplikacím při kvantitativním stanovování popsaným v předcházející kapitole, je použití interního standardu velmi výhodné, neboť tak do značné míry může tyto problémy eliminovat.

V pivovarské analytice se při head-space analýze interní standardy využívají. Jejich přehled u těch nejvýznamnějších metod uvádí tab. 3.

Tab. 3 Přehled látek používaných jako vnitřní standardy v hlavních pivovarských head-space metodách

5 ZÁVĚR

I přes rozvoj nových, zejména mikroextrakčních technik jako mikroextrakce na pevné fázi (SPME), sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) a dalších, zaujímá head-space metoda stále pevné místo při analýze těkavých látek, a to především díky své jednoduchosti a možnosti plné automatizace. Své stálé místo si našla i při běžných pivovarsko-sladařských analýzách, kde se uplatňuje její statické provedení s využitím interních standardů.