Výhody a nevýhody záměny helia jako nosného plynu v plynové chromatografii za vodík. Část II. – Retenční časy a selektivita
Pixabay/Michael Gaida: Nosný plyn v plynové chromatografii - helium a vodík
1 ÚVOD
Jak bylo ukázáno v předešlém článku, problémy s dostupností helia spolu s jeho vzrůstající cenou jsou důvodem, proč je nutné i v plynové chromatografii se zabývat otázkou záměny helia jakožto nosného plynu za jiný, vhodný plyn (Horák et al., 2013).
V tomto článku je porovnáno použití helia a vodíku v plynové chromatografii a poukázáno na praktické aspekty přechodu plynově chromatografických metod z helia na vodík s ohledem na uplatnění v pivovarské analytice.
2 TEORIE
K vyjádření účinnosti chromatografické kolony se používá počet teoretických pater kolony (N) nebo výškový ekvivalent teoretického patra (H = L/N, kde L je délka kolony). Výškový ekvivalent teoretického patra je funkcí průměrné lineární rychlosti nosného plynu (ū), kterou pro kapilární kolony popisuje Golayova-Giddingsova rovnice (Golay, 1958a; Giddings et al., 1960). Tato závislost je funkcí průměru kolony (dc), tloušťky stacionární fáze (df), kapacitního faktoru (k) a difúzních koeficientů analytu v mobilní a stacionární fázi. Pro danou kolonu a daný analyt získáme pro různé plyny (vodík, dusík, helium) tři různé van Deemterovy křivky (obr. 1).
Obr. 1 H – ū křivky pro nosné plyny vodík (kroužek), helium (čtverec), dusík (kosočtveec).(Korytár, Matisová, 2001)
Z těchto závislostí vyplývají následující důležité skutečnosti.
Pro všechny nosné plyny je minimální hodnota H prakticky nezávislá na typu nosného plynu. Z toho plyne, že za předpokladu nastavení optimální průměrné rychlosti nosného plynu všechny tři plyny poskytují srovnatelnou účinnost a rozlišení.
Optimální rychlost plynu je nejvyšší pro vodík ve srovnání s heliem nebo dusíkem. Pro standardní kapilární kolony (délka 10–50 m, vnitřní průměr 0,25–0,32 mm a tloušťka filmu 0,1–0,5 μm) při optimální rychlosti je vodík 1,5krát rychlejší než helium a 3,3krát rychlejší než dusík, přičemž výškový ekvivalent teoretického patra je přibližně stejný.
Strmost křivek klesá v pořadí dusík – helium – vodík. To znamená, že pokud použijeme dusík při práci s vyšší rychlostí plynu než je optimální rychlost, dochází k rychlému poklesu účinnosti. Naopak v případě vodíku lze rychlost plynu zvýšit bez výrazné ztráty účinnosti. Helium, jak je patrné z obrázku, má střední strmost. Při zmenšování průměru kolony klesá strmost této křivky, křivka se stává plošší a zvyšuje se hodnota optimální rychlosti. V důsledku je tedy možné zvyšovat rychlost nosného plynu bez výrazného snížení účinnosti (David, Sandra, 1999; Horák et al., 2009).
Z výše uvedených důvodů tedy vyplývá, že pro náhradu helia je vodík vhodnější než dusík.
3 RETENČNÍ ČASY
Obecně řečeno platí, že chromatogram (retenční časy, účinnost, rozlišení a selektivita) je ovlivněn výběrem mobilní fáze. V plynové chromatografii je však tento fakt podstatně méně významný než v kapalinové chromatografii. Nosný plyn v plynové chromatografii jen výjimečně interaguje se stacionární fází nebo s analyty. Hlavním úkolem nosného plynu je zajistit transport analytů kolonou, a tak zajistit interakce mezi unášenými analyty a stacionární fází kolony.
V procesu plynově chromatografické separace se uplatňují především dvě vlastnosti nosného plynu – difuzivita a viskozita plynu. Difuzivita vodíku a helia je zhruba stejná, ale viskozita vodíku je při stejné teplotě méně než poloviční. Z tohoto důvodu je k dosažení stejné optimální průměrné rychlosti jako u helia zapotřebí u vodíku nižšího tlaku.
I když vztah mezi lineární rychlostí a tlakem není v důsledku stlačitelnosti nosného plynu zcela lineární, všeobecně se dá říci, že při záměně helia za vodík se při nezměněném tlaku na hlavu kolony retenční časy zkrátí zhruba na polovinu.
Retenční časy v plynové chromatografii ovlivňuje řada faktorů. Distribuční koeficient látky procházející kolonou, ten však nezávisí na typu nosného plynu; parametry kolony jako je její délka, vnitřní průměr, tloušťka stacionární fáze; průměrná lineární rychlost nosného plynu (Chromacademy, online).
3.1 Izotermická separace
Lineární rychlost plynu je kromě rozměrů kolony a vstupního tlaku plynu ovlivněna viskozitou nosného plynu. Vodík se vyznačuje asi poloviční viskozitou než helium nebo dusík při dané teplotě. Z tohoto důvodu je u vodíku k dosažení dané konstantní průměrné lineární rychlosti jako u helia nebo dusíku potřebný podstatně nižší vstupní tlak. Pokud zůstane u vodíku stejná lineární rychlost jako u helia, potom se nezmění ani retenční časy, avšak vstupní tlak pro vodík bude zhruba poloviční ve srovnání s heliem.
Naopak, pokud se zvolí konstantní vstupní tlak pro vodík jako pro helium, pak budou píky jednotlivých analytů eluovány v kratších retenčních časech, protože lineární rychlost vodíku bude větší než helia. Retenční časy se při stejném vstupním tlaku tedy zkrátí asi o polovinu.
Při použití konstantního průtoku bude výsledek mezi konstantní lineární rychlostí a konstantním tlakem (Chromacademy, online).
3.2 Teplotní program
Při použití teplotního programu je situace komplikovanější. Pokud se pomocí elektronického pneumatického systému podaří udržovat konstantní lineární rychlost, retenční časy zůstanou stejné. Ale ne každý pneumatický systém plynových chromatografů je schopen kontrolovat lineární rychlost nosného plynu.
Za použití módu konstantního tlaku se při použití vodíku budou látky eluovat rychleji. Současně se ale bude snižovat i jejich eluční teplota, což povede ke změnám v jejich relativních retenčních časech v závislosti na chemické povaze stanovovaných látek.
Podobného výsledku pouze s menším účinkem bude dosaženo při analýze při konstantním průtoku (Chromacademy, online).
4 PRAKTICKÝ PŘÍKLAD PŘI ANALÝZE PIVA
Vzhledem k tomu, že teorie plynové chromatografie je velmi dobře popsána, byly vyvinuty programy, které při použití kolony se stejnými parametry umožňují “přeložit“ pracovní podmínky chromatografické separace při změně nosného plynu (Snyder, et. al., 1992; Quimby et. al., 1995). Díky tomu odpadá složité a hlavně časově náročné hledání nových vhodných podmínek pro separaci při použití jiného nosného plynu. Jedním z takových překladových programů je např. GC Method Translation Software volně přístupný na internetových stránkách firmy Agilent Technologies (Agilent, online).
S pomocí tohoto software je možné ukázat, jak se změní podmínky při separaci některých významných senzoricky aktivních látek v pivu při záměně helia za vodík nebo dusík.
V tab. 1 jsou demonstrovány změny při separaci těkavých senzo-ricky aktivních látek v pivu na koloně J&W DB-WAX, 60 m, 0,32 mm, 0,25 μm.
Pokud bude cílem při změně nosného plynu zachovat retenční časy, je nutné zachovat u všech plynů stejnou lineární rychlost. Po-tom poklesne hodnota vstupního tlaku nosného plynu, u vodíku na méně než polovinu. Jak ale vyplývá z van Deemterovy křivky (obr. 1), lineární rychlost dusíku 36,4 cm/s je již nad minimální hodnotou výškového ekvivalentu teoretického patra a v této oblasti již může docházet k poklesu účinnosti kolony.
Tab. 1 Chromatografické podmínky separace některých těkavých senzoricky aktivních látek v pivu na koloně J&W DBWAX, 60 m, 0,32 mm, 0,25 μm při záměně nosného plynu helia za vodík nebo dusík ve dvou modelových příkladech – A) zachování retenčních časů; B) „překladu“ původní metody pomocí GC Method Translation Software v modu „translate only“
V tab. 1 jsou dále ukázány výsledky vypočtených parametrů „přeložené“ původní metody pomocí software GC Method Translation Software. „Přeložená“ lineární rychlost u vodíku je asi 1,5krát větší než u helia, v případě dusíku 2,3krát menší než u helia. Při analýze s vypočteným teplotním programem je tedy analýza u vodíku 1,5krát rychlejší, zatímco při použití dusíku zhruba 2,3krát pomalejší.
V poslední době vzrůstá popularita rychlejší plynové chromatografie. V tab. 2 jsou ukázány změny podmínek při separaci některých méně těkavých senzoricky aktivních látek v pivu právě na koloně umožňující tuto rychlejší chromatografii – J&W DB-WAX, 10 m, 0,18 mm, 0,18 μm.
Při zachování požadavku na stejné retenční časy je nutné dodržet stejnou lineární rychlost u všech plynů, konkrétně 84 cm/s. Vzhledem k tomu, že při zmenšení průměru kolony na 0,18 mm se van Deemterovy křivky stávají plošší, je možné u helia i vodíku pracovat s touto rychlostí nosného plynu. Pro dusík už není možné doporučit takto vysokou hodnotu lineární rychlosti vzhledem ke snížení separační účinnosti kolony, která se projeví zhoršenou separací kritických párů analytů.
V další části tab. 2 jsou dále ukázány výsledky vypočtených parametrů „přeložené“ původní metody pomocí software GC Method Translation Software. Díky malé strmosti van Deemterovy křivky pro vodík při tomto průměru kolony je možné v případě vodíku jako nosného plynu pracovat s vysokou hodnotou lineární rychlostí 129 cm/s, a tak dosáhnout dalšího výrazného zrychlení analýzy (1,53krát vzhledem k heliu). V případě použití dusíku se lineární rychlost 39 cm/s dostává do optimální oblasti separační účinnosti kolony, ale délka analýzy se prodlouží asi 2,1krát ve srovnání s heliem.
Tab. 2 Chromatografické podmínky separace některých méně těkavých senzoricky aktivních látek v pivu na koloně J&W DB-WAX, 10 m, 0,18 mm, 0,18 μm při záměně nosného plynu helia za vodík nebo dusík ve dvou modelových příkladech – A) zachování retenčních časů; B) „překladu“ původní metody pomocí GC Method Translation Software v modu „translate only“
5 ZÁVĚR
Při záměně helia jako nosného plynu v plynové chromatografii je jednoznačně výhodnější zvolit vodík než dusík. Díky výhodnému průběhu van Deemterovy křivky umožňuje vodík poskytnout nejvyšší separační účinnost kolony při nejvyšší lineární rychlosti z porovnávaných plynů. Díky tomu je možné dosáhnout nejrychlejších analýz při nižším vstupním tlaku než u ostatních srovnávaných plynů.