Česká chromatografická škola - HPLC.cz 2023 - Den 2

Pondělní program konference byl zahájen slavnostním předáním Hanušovy medaile, kterou obdržel RNDr. Václav Kašička, CSc. z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR za významný přínos v oblasti rozvoje elektromigračních metod. Následovala pak plenární přednáška na téma využití kapilární elektroforézy v klinické praxi na příkladu zkoumání diabetes.

Následoval blok vzdělávacích přednášek zaměřených na využití výpočtů a matematických modelů v optimalizacích a plánování experimentálních podmínek v HPLC. Přednáška společnosti Pragolab nám přiblížila analytické a konfigurační možnosti kapalinových chromatografů Thermo Scientific Vanquish.

Blok 3 přednášek z analytické praxe a využití HPLC v různých typech komerčních laboratoří nám přiblížil potřeby validací metod, falšování medu nebo analytických metod v oblasti farmaceutických analýz.

Po obědní pauze nás čekala přednáška o možnostech "Inteligentního" LC/MS trojitý kvadrupólu Agilent 6475 od společnosti HPST. Následně jsme v sérii 4 přednášek nahlédli na praktické aplikace spojení separačních technik a hmotnostní spektrometrie jako jsou moderní archeologie a památková péče, detektor Agilent iQ v praxi, analýza kontaminantů jako jsou pesticidy, léčiva a dalších xenobiotika nebo PFAS v životním prostředí.

Poslední odborný blok přednášek navázal na analýzu PFAS systémem PerkinElmer QSight LC/MS/MS od společnosti PE Systems. Další 3 přednášky se zaměřily na techniku superkritické fluidní (SFC) a plynové (IGC) chromatografie v oblasti středně polárních-bazických nebo přírodních látek.

Odborný program uzavřel soutěžní WORKSHOP GENERÁLNÍHO PARTNERA konference společnosti Pragolab a večer nám kulturní a společenský program oživila cimbálová muzika Primáš.

Pondělí 15. 05. 2023

PLENÁRNÍ PŘEDNÁŠKA

09:00 – 09:10 Slavnostní předání Hanušovy medaile

• Jan Petr

HPLC.cz: Slavnostní předání Hanušovy medaile pro RNDr. Václava Kašičku, CSc

09:10 – 10:00 Jak zkoumat diabetes elektroforézou

• Petr Tůma

Obezita patří mezi nejčastější civilizační choroby a přináší s sebou celou řadu zdravotních komplikací v podobě Diabetess melitus II. typu, metabolického syndromu, kardiovaskulárních onemocnění a řady dalších nemocí, které jsou v rozvinutých zemích příčinou 60% úmrtí. Pro studium obezity a diabetu na molekulární úrovni je potřeba sledovat energetické substráty, metabolity a léčiva v klinických vzorcích. Pro tyto účely je vhodné používat kapilární elektroforézu, která se vyznačuje vysokou separační účinností, minimálními požadavky na množství klinického materiálu a jeho úpravu a také krátkou dobou separace. V kombinaci s bezkontaktní vodivostní detekcí, která je univerzální detekční technikou nevyžadující derivatizaci vzorku, představuje kapilární elektroforéza silný nástroj pro monitorování metabolických procesů.

V rámci přednášky budou diskutována elektroforetická stanovení aminokyselin a jejich on-line prekoncentrace v kapiláře. Dále budou představeny separace metabolitů a léčiv s protisměrným laditelným elektroosmotickým tokem v pokrytých kapilárách. Pozornost bude věnována on-line spojení kapilární elektroforézy s mikrodialyzačním vzorkováním prostřednictvím flow-gating interfaces.

HPLC.cz: Jak zkoumat diabetes elektroforézou (Petr Tůma)

1. JAK SE PŘESTAT BÁT VÝPOČTŮ V LC?

• předseda sekce: L. Nováková

10:00 – 10:30 Nebojte se matematického plánování

• Jiří Urban

Výsledky každé analytické metody jsou závislé na nastavení experimentálních podmínek a jejich vlivu na registrovaný signál. Jedním z nejzákladnějších přístupů při hledání optimálních podmínek je postupná optimalizace, kdy operátor mění nastavení těchto podmínek a sleduje jejich vliv na odezvu. Tento přístup je relativně jednoduchý a vyžaduje pouze znalost fyzikálně-chemických zákonitostí dané metody. Na druhou stranu, v případě postupné optimalizace nemusí dojít k odhalení vzájemných vlivů experimentálních faktorů a – ač jednoduchý – může být tento přístup i časově náročnější a ve výsledku tedy dražší.

Vhodnou alternativou jsou přístupy matematického plánování. V těchto případech dochází nejprve k definici hladin experimentálních podmínek (např. rozsah pH, použitá teplota analýzy, složení reakční směsi), které musí vycházet ze znalosti dané metody a fyzikálněchemických omezení. Následuje popis experimentálního prostoru daný vybraným experimentálním plánem. Po změření navržených experimentálních podmínek je na základě regresní analýzy vytvořen matematický model umožňující předpovědět výsledek i těch experimentálních podmínek, které nebyly součástí původního plánu. Výhodou je také snadná vizualizace vlivu podmínek na odezvu. V případě nutnosti je možné tento postup následně zopakovat pro úžeji vybrané experimentální podmínky.

Přednáška se bude věnovat popisu a názorné ukázce optimalizace experimentálních podmínek elektrospreje pomocí přístupu matematického plánování. Hlavním cílem bude nalézt vhodné podmínky pro zvýšení citlivosti stanovení steroidů pomocí UHPLC-MS/MS. Pro demonstraci postupu optimalizace bude použit programovací jazyk R a výsledný kód bude k dispozici účastníkům konference.

HPLC.cz: Nebojte se matematického plánování (Jiří Urban)

10:30 – 11:00 Výpočetní metody optimalizace 1D a 2D separací

• Petr Česla

The development and optimization of the chromatographic method represents a significant challenge, primarily when the rigorous computational approach should be used instead of a simple trial-and-error approach. The first part of computational optimization is usually the establishment of accurate and reliable retention models based on representative compounds. Based on the retention modeling, either isocratic or gradient retention data can be predicted. A map of the target criterion is calculated, i.e., resolution, peak capacity, or chromatographic optimization function, which enables the selection of optimal separation conditions. In two-dimensional liquid chromatography, the optimization process is complicated due to the interfacing of two separation techniques, which may yield mobile phases incompatibility, altered retention due to the mismatch of solvent strengths used in both dimensions and loss of resolution connected with the fraction transfer process (i.e., due to the undersampling of the first dimension). In the presentation, the most critical issues of computational optimization of 1D and 2D separations will be addressed, and the general guidelines for optimization will be provided.

HPLC.cz: Výpočetní metody optimalizace 1D a 2D separací (Petr Česla)

11:00 – 11:30 Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

HPLC.cz: Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

Přednáška generálního sponzora

11:30 – 11:45 The Thermo Scientific Vanquish HPLC system and its different flavors

• Alexandra Manka (Pragolab)

HPLC.cz: The Thermo Scientific Vanquish HPLC system and its different flavors (Alexandra Manka)

2. VYUŽITÍ HPLC V ANALYTICKÉ PRAXI

• předseda sekce: P. Česla

11:45 – 12:05 Chromatografie ve firemní praxi

• Lenka Zlatníčková

HPLC instrumentation and separations require a fundamental understanding of how the instrument functions and how the separation works. Even in case we know our HPLC instrument very well and the method is properly developed and validatd, there are always challenges appearing within the routine testing.

The presentation provides examples of HPLC issues and challenges, we have observed in our laboratory together with the applied solutions.

HPLC.cz: Chromatografie ve firemní praxi (Lenka Zlatníčková)

12:05 – 12:25 Med a jeho falšování

• Roman Hamtil

Honey, natural product of bee (Apis mellifera), belongs among five most frauded foodstuff in the world, in the long term. It could be contaminated by bee feed residuals but more and more often it is purposefully modified by artificial sugar syrups. In fact, honey is, apart from traces of vitamins, minerals, proteins, and other organic natural compounds and pollen particles, mainly dissolved sugars (fructose, glucose + other sugars in water), while dry substance should be higher than 80 % (with exceptions). Many characterization methods have been developed. They can recognize honey treatment and storing at bad conditions (heating) and also adding the artificial substances. As the first marker compound – hydroxymethylfurfural (HMF) was found. It is created from fructose decomposition by heat, and it is measured in low concentrations (ppm) by several methods including HPLC. Now there are many sugar decomposition products as dihydroxyacetone, mannose etc. and typical enzymes monitored. Very specific methods are based on HPLC-NMR where δ13C isotopes of individual components can determine its origin even the geographic location. New methods are still being and must be developed because of continual improvement of “honey” manufacturers and their products.

HPLC.cz: Med a jeho falšování (Roman Hamtil)

12:25 – 12:55 Osud analytické metody ve farmaceutické firmě

• Barbora Filounová
• Ivana Šestáková

Cayman Pharma s.r.o. se zabývá výrobou prostaglandinových aktivních farmaceutických látek a je proslulá na světovém trhu. Jak naložit s osudem analytické metody ve farmaceutické firmě? Přednáška přiblíží pohled na toto téma očima analytika výzkumu a vývoje a zároveň očima pracovníka kontroly kvality. Bude se pohled lišit? Určitě ano, avšak cíl bude vždy společný, neboť víme, že analytická kontrola je a vždy bude stěžejním bodem v procesu farmaceutické výroby. Přednáška shrne vývoj analytické metody, její transfer na oddělení kontroly kvality a následnou validaci metody. Avšak úspěšnou validací to zdaleka nekončí…

HPLC.cz: Osud analytické metody ve farmaceutické firmě (Barbora Filounová, Ivana Šestáková)

13:00 – 14:30 Oběd

Přednáška sponzora sekce

14:30 – 14:40 Agilent 6475: "Smart" LC/MS trojitý kvadrupól pro produktivní laboratoř

• Jitka Zrostlíková (HPST)

HPLC.cz: Agilent 6475: Smart LC-MS trojitý kvadrupól pro produktivní laboratoř (Jitka Zrostlíková)

3. SPOJENÍ SEPARAČNÍCH METOD S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ

• předseda sekce: O. Novák

14:40 – 15:10 Chromatografie a hmotnostní spektrometrie v moderní archeologii a památkové péči - vybrané aspekty

• Petr Bednář

Chemical analysis is an important source of knowledge for modern archaeology, monument care and cultural heritage research. In this communication, capability of direct mass spectrometry and its combination with gas and liquid chromatography will be discussed and documented on selected case studies. Archaeological Biomarker Concept will be introduced and the current extent of its use will be described. Often, multimodal analysis utilizing other (virtually non-invasive) spectral techniques (e.g. Raman microscopy, X-ray fluorescence and photoelectron spectroscopy) is necessary to obtain requested information.

The potential of GC/MS and Atmospheric Solids Analysis Probe Mass Spectrometry (ASAP-MS) was studied for detection of miliacin as a marker of millet in soil taken from excavated vessels. The proof of this cereal was possible even if grain residues were not found in sample for paleo-botanical expertise due to their extensive treatment and/or decomposition. Analysis of acylglycerols and other fat components can be used to detect various food residues in excavated vessels (e.g. milk or dairy products) and binders in artworks. This study was based on GC/MS, MALDI-MS and ELISA. GC/MS and LC/MS methods are used for the detection of phenolic compounds and products of their transformation in model and historical samples (e.g. medieval vessels content, etc.).

HPLC.cz: Chromatografie a hmotnostní spektrometrie v moderní archeologii a památkové péči - vybrané aspekty (Petr Bednář)

15:10 – 15:30 Praktické aplikace iQ detektoru

• Petr Česla

The coupling of liquid chromatography with mass spectrometry is a routine technique with the benefits of unequivocal identification of sample components and better quantification (higher linear dynamic range, lower detection limits, and higher accuracy) compared to spectrophotometric detection. In the present contribution, the simple and user-friendly instrumentation will be reviewed on several analytical applications, including the determination of acetaminophen oxidation metabolites, glutathione related metabolites, and analysis of naturally occurring antioxidant compounds in various food matrices.

HPLC.cz: Praktické aplikace iQ detektoru (Petr Česla)

15:30 – 15:50 Stanovení pesticidů, léčiv a dalších xenobiotik pomocí LC-MS/MS

• Martin Ferenčík

Organické mikropolutanty (OM, xenobiotika, jmenovitě pesticidy, léčiva a jejich metabolity a další kontaminanty, jako například perfluorované sloučeniny (PFAC), inhibitory koroze, tenzidy, atp.) tvoří velkou skupinu látek, která se často vyskytuje v povrchových vodách o koncentracích v řádu ng/l až μg/l. Svými ekotoxikologickými vlastnostmi často vzbuzují obavy (Emerging Contaminats) lidí z pohledu zásobování nezávadnou pitnou vodou, ale také ohrožení biodiverzity a života ve vodě vůbec.

Ke stanovení polárních mikropolutantů se s výhodou používá velice citlivá a selektivní technika kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LCMS/MS). Nejcitlivější modely umožňují stanovovat vybrané pesticidy, léčiva a jejich metabolity technikou přímého nástřiku desítek až stovek mikro litrů vodných vzorků po jejich předchozí filtraci, upravení pH a obohacením izotopově značenými standardy (ILS) na úrovni jednotek až desítek ng/l, což postačuje pro splnění legislativních limitů a podchycení nálezů v reálných vzorcích. Pro některé látky, např. estrogenní hormony, je pořád nutné zakoncentrování před LC-MS/MS analýzou.

Hlavními výzvami při analýze organických mikropolutantů jsou nalezení vhodného separačního systému (mobilní fáze - stacionární fáze) z pohledu zádrže sledovaných analytů a oddělení od netěkavých solí a komplikované matrice, a také eliminace někdy značných matričních efektů (potlačení nebo naopak navýšení odezev při ionizaci - Ionization Suppresion, Ionization Enhancement). S výhodou se používá technika izotopového zřeďování nebo metoda standardního přídavku.

HPLC.cz: Stanovení pesticidů, léčiv a dalších xenobiotik pomocí LC-MS/MS (Martin Ferenčík)

Následující obrázek 1 ilustruje nálezy stabilních léčiv gabapentinu a metforminu v ng/l ve vodárenské nádrži v místě odběru surové vody v letech 2019 až 2022.

15:50 – 16:10 Stanovení PFAS v životním prostředí

• Václav Šístek

Per/Polyfluoroalkylated Compounds (PFAS), formerly known as Perfluorinated Compounds (PFCs), are persistent organic environmental pollutants. It is currently reported that there are more than 5,000 of these compounds. Their unique properties, which result from the carbon-fluorine bond, have led to significant expansion in many industries. These substances are very stable and enter the environment, where they accumulate. Therefore, their residues are detected in various components of the environment, not only in industrial areas.

The two best-known representatives of PFAS: perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoic acid (PFOA) have been included in the Stockholm Convention and their use is currently banned. From 1.1.2022, a limit of 0.1 μg/L for the sum of 20 PFAS is required in drinking water according to DIRECTIVE OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL (EU) 2020/2184 of 16 December 2020 on the quality of water intended for human consumption. To achieve such low limits, we use state-of-the-art instrumentation, LC-MS/MS (ultra-high performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry) in a special configuration, mostly in combination with sample concentration.

ALS Czech Republic has extensive experience with PFAS analysis. We have been analyzing PFAS since 2013. We currently analyze more than 25,000 samples per year in various matrices from many regions, especially in Europe. The analyzes are mainly focused on matrices of environmental origin: water, soils, sediments, etc. Our methods allow detection of PFAS in very low concentration (< 1 ng/L in drinking water). We are gradually optimizing and expanding our methods, currently the methods include 58 target analytes. This scope will be further expanded in connection with current requirements from both legislation and customers. At the same time, methods in other matrices will be validated.

HPLC.cz: Stanovení PFAS v životním prostředí (Václav Šístek)

16:10 – 16:40 Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

HPLC.cz: Přestávka na kávu a diskuse u plakátových sdělení

Přednáška sponzora sekce

16:40 – 16:50 Novinky 2023 PerkinElmer

• Pavel Šmejda (PE Systems)

HPLC.cz: Novinky 2023 PerkinElmer (Pavel Šmejda)

4. SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ A PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE

• předseda sekce: K. Lemr

16:50 – 17:20 Superkritická fluidní chromatografie středně polárních-bazických látek

• Ondřej Novák

V rostlinné říši patří mezi středně polární-bazické látky i jedna skupina fytohormonů, cytokininy (CK). Tyto N6-subtituované deriváty adeninu jsou důležitými signálními molekulami, které regulují růst a vývoj rostlin. CK se vyskytují v rostlinných pletivech v mnoha izomerních formách a ve velmi nízkých koncentracích (fmol-pmol/g čerstvé hmoty). Moderní metody pro stanovení CK jsou v současnosti založeny na ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografii spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (UHPLC-MS/MS). Nyní byla ve fytohormonální analýze poprvé použita superkritická kapalinová chromatografie vybavená hmotnostně-spektrometrickou detekcí (SFC-MS/MS). Vyvinuli jsme rychlou a citlivou metodu pro stanovení 35 CK metabolitů pomocí SFC-MS/MS. Chromatografie byla testována na čtyřech různých kolonách s různými retenčními mechanismy a za optimální stacionární fázi byl zvolen hybridní oxid křemičitý modifikovaný 2-pikolylaminem. Pro dosažení rychlé separace bylo optimalizováno několik parametrů (teplota kolony, zpětný tlak, složení mobilní fáze i make-up rozpouštědla). Ve srovnání s UHPLC-MS/MS umožnila finální sedmiminutová gradientová SFC eluce následovaná dvouminutovým ekvilibračním krokem až trojnásobné zrychlení separace. Citlivost metody byla chrakterizována limitem kvantifikace (0,5 fmol v nástřiku) a testovaná spolehlivost metody vykazovala vysokou přesnost a preciznost (pod 15 % pro většinu analytů). Metoda byla validována na komplexní rostlinné matrici modelové rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) a získané profily CK metabolitů byla porovnány s výsledky z konvenční UHPLC-MS/MS metody.

HPLC.cz: Superkritická fluidní chromatografie středně polárních-bazických látek (Ondřej Novák)

17:20 – 17:40 Superkritická fluidní chromatografie v analýze přírodních látek

• Lucie Nováková

Popularita a možnosti využití superkritické chromatografie (SFC) v posledním desetiletí výrazně vzrostly. Důvodem jsou vlastnosti a výhody metody SFC, které zahrnují vysokou separační účinnost, rychlé analýzy a odlišnou selektivitu ve srovnání s dalšími separačními technikami, tedy LC a GC. Současná SFC využívá přístrojové vybavení na bázi LC. Pro separaci lze flexibilně vybírat ze široké škály specializovaných SFC a LC stacionárních fází. Mobilní fází je obvykle ternární směs oxidu uhličitého, organického modifikátoru a aditiva. Metoda SFC si našla mnohá uplatnění v oblasti analýzy přírodních látek, kdy může být řešením problematických separací izomerních látek, látek nestabilních ve vodném prostředí nebo alternativou GC pro současnou analýzu těkavých a netěkavých složek extraktu.

Analýza kanabinoidů je v současnosti důležitým tématem ve spojení s otázkou legalizace produktů s obsahem konopného extraktu. Metoda SFC-MS/MS je velmi vhodným nástrojem v analytickém měřítku, ale nadkritické tekutiny lze využít i pro extrakci a v preparativním měřítku. V naší laboratoři byl vyvinut postup využívající superkritickou fluidní extrakci (SFE) pro extrakci frakce kanabinoidů z rostlinných materiálů a další metody extrakce pro analýzu různých konopných produktů. Analytický krok byl realizován pomocí UHPSFC-MS/MS. Ještě zajímavější možností je využití metody SFE s různými typy extrakčních rozpouštědel pro izolaci těkavé a polárnější frakce. Tento přístup byl využit pro analýzu obsahových látek z listů Eukalyptu.

HPLC.cz: Superkritická fluidní chromatografie v analýze přírodních látek (Lucie Nováková)

17:40 – 18:00 Inverzní plynová chromatografie

• Jakub Heřt

Inverse Gas Chromatography (iGC) has become an increasingly important technique in the material industry for the characterization of films, fibers, and powders of both crystalline and amorphous forms, iGC is particularly useful for studying the surface properties of materials, including surface energy, enthalpy and entropy of sorption, surface energy, work of cohesion and adhesion, solubility parameters, surface heterogeneity, and glass transition. This presentation will describe the various applications of iGC in the pharmaceutical industry.

The presentation will begin by introducing the principles of iGC and the various parameters that can be obtained through the analysis. Then will be discussed the applications of iGC in the pharmaceutical industry, including the characterization of surface properties of active pharmaceutical ingredients (APIs) and excipients, their mutual interaction, and finally also impact of preparation methods.

Overall, this presentation will demonstrate the versatility and usefulness of iGC in the pharmaceutical industry and its potential for solving analytical challenges in drug discovery, development, and manufacturing.

HPLC.cz: Inverzní plynová chromatografie (Jakub Heřt)

18:00 – 18:15 WORKSHOP GENERÁLNÍHO PARTNERA: Novinky v kapalinové chromatografii Thermo Scientific a soutěž o ceny

• Z. Snížková, F. Zaleš (Pragolab)

HPLC.cz: WORKSHOP GENERÁLNÍHO PARTNERA: Novinky v kapalinové chromatografii Thermo Scientific a soutěž o ceny

19:00 Večeře, cimbálová muzika Primáš

HPLC.cz: Večeře, cimbálová muzika Primáš