Základní detektory v plynové chromatografii používané v pivovarské analytice

Plynová chromatografie je významnou analytickou technikou používanou při stanovování senzoricky aktivních látek, jejichž obsah je důležitý nejen pro sledování kvality již finálního výrobku, ale též při testování nových technologických postupů. V pivovarsko-sladařské analytice patří mezi nejpoužívanější detektory v plynové chromatografii plamenoionizační detektor (FID), detektor elektronového záchytu (ECD) a plamenofotometrický detektor (FPD). Práce se zabývá principy jednotlivých detektorů, jejich přednostmi a omezeními při jejich použití v pivovarské analytice.

1 ÚVOD

Plynově chromatografické postupy pro stanovení senzoricky aktivních látek v pivu jsou součástí všech oficiálních metodik pivovarských organizací jako je European Brewery Convention (EBC), Mitteleuropäische Brautechnische Analysenkommission (MEBAK), The Institute of Brewing (IOB) nebo The American Society of Brewing Chemists (ASBC). Touto separační technikou lze v meziproduktech a hotovém pivu stanovit jak senzoricky významné látky, tak některé cizorodé látky. Přehled těchto látek včetně použitého typu detektoru uvádí tab. 1.

Tab. 1 Přehled látek stanovovaných plynovou chromatografií v pivovarské analytice podle typu detektoru.

Plamenoionizační detektor (FID) se stal bezesporu základním, nejrozšířenějším detektorem v plynové chromatografii. Detektor elektronového záchytu (ECD) a plamenofotometrický detektor (FPD) se oproti FID vyznačují větší selektivitou a citlivostí pro vybrané skupiny látek, a proto našly široké uplatnění.

Detektor, který má selektivní odezvu pouze na stanovované látkya nedetekuje ostatní sloučeniny, umožňuje dvojím způsobem zefektivnit analýzu. Jednak není třeba věnovat se tak pečlivému čištění vzorku za účelem odstranění interferujících látek během jeho přípravy pro vlastní plynově chromatografické stanovení. Dále je možné použít rychlejší chromatografii, protože vzhledem k selektivitě není nutné dosáhnout perfektní separace všech látek obsažených v analyzované směsi.

Z těchto důvodů se selektivní detektory staly velmi oblíbenými. Přesjejich nesporné výhody však jejich použití může narážet na některé problémy, způsobené buď nesprávným pochopením pracovního módu detektoru, nebo neúplným využitím jeho možností.

V článku jsou popsány principy výše uvedených detektorů a praktické aspekty jejich použití v pivovarské analytice.

2 PLAMENOIONIZAČNÍ DETEKTOR (FID)

Plamenoionizační detektor se vyznačuje velmi širokým dynamic-kým rozsahem a vysokou citlivostí a s výjimkou několika nízkomolekulárních látek detekuje všechny látky s uhlíkem. Poprvé FID popsalisoučasně Halley a Pretorious (25) a McWiliams a Dewer (26). Vodíkse směšuje s eluentem z GC kolony a hoří v malé trysce. Cylindrickáelektroda obklopuje plamínek a mezi trysku a elektrodu je vloženorelativně vysoké napětí, které sbírá ionty formující se v plameni. Vý-sledný proud je zesílen vysokoimpedančním zesilovačem a na vý-stupu veden do data akvizičního systému. Detektor vyžaduje zpravi-dla tři nezávislé plyny společně s jejich přesnou regulací. Obvykle sepoužívají vodík pro hoření, helium nebo dusík jako nosný plyn proté-kající kolonou a dále pak kyslík nebo vzduch pro podporu hoření. Detektor je vybaven nezávislým vyhříváním. Odezva FID je na teplotězávislá jen minimálně, hlavním důvodem dostatečného vyhřívání de-tektoru je zabránit kondenzaci v detektorovém prostoru.

2.1 Princip FID

V roce 1960 pečlivě popsali princip ionizace Ongkiehong (27) a Desty (28). Od té doby tak detailní popis tohoto detektoru nikdo neuveřejnil. Původně se předpokládalo, že ionizační mechanizmus v plamínku FID je podobný ionizačnímu procesu v uhlovodíkovém plameni, který intenzivně studoval Calcote a King (29), a dále pak Schuler a Weber (30) v polovině 50. let minulého století. V současnosti je přijímáno vysvětlení, že ionty nevznikají termální ionizací, ale termální emisí z mikroskopických uhlíkových částeček, které vznikají během procesu spalování. Proto dominantním faktorem při ionizaci organických látek není jejich ionizační potenciál, ale závislost na uhlíku, který přechodně vzniká během hoření.

Plasma v plamínku obsahuje jak kladné ionty, tak elektrony, které jsou sbírány buď na trysce, nebo elektrodě v závislosti na polaritě vloženého napětí. Zpočátku se proud zvyšuje s vloženým napětím, jeho velikost závisí na umístění elektrody. Proud se zvětšuje s vkládaným napětím, až dosáhne plata, při kterém zůstává prakticky konstantní. Napětí, při kterém je tohoto plata dosaženo, je také závislé na vzdálenosti elektrod. Po vzniku elektronů nebo iontových párů se začíná uplatňovat rekombinace. Čím je větší vzdálenost mezi elektrodami a/nebo nižší napětí, tím větší je rekombinace. Tuto skutečnost dokládají křivky naměřené Ongkiehongem, ze kterých vyplývá, že plata je dosaženo při nižším napětí, pokud jsou elektrody blíže k sobě. Za všech podmínek nastavení elektrod dosahuje plato stejné hodnoty. Předpokládá se, že v plato jsou všechny ionty a elektrony vzniklé v plamínku sebrány na elektrodách. V praxi by vložené napětí mělo být nastaveno tak, aby vzhledem ke vzdálenosti elektrod bylo zajištěno, že všechny elektrony a ionty budou sebrány.

2.2 Fungování FID

Detektor FID je pravděpodobně nejjednodušším, nejsnazším a nej-spolehlivějším z používaných detektorů. Vhodné průtoky pro jednotlivéplyny jsou výrobcem popsány v návodu. Průtok vodíku se obvykle na-stavuje v rozmezí 20 až 30 ml/min, průtok vzduchu je asi 6krát většínež vodíku, tedy 120 až 200 ml/min. Průtok nosného plynu kapilárníkolonou může být menší než 1 ml/min. Jako nosný plyn se obvyklepoužívá helium, dusík, argon atd. Výhodou detektoru je jeho samo-čištění, takže málokdy dojde k jeho kontaminaci, i když tato skutečnosttaké závisí od analyzovaných látek. V případě pivovarsko-sladařskýchanalýz však ke kontaminaci detektoru FID dochází minimálně.

3 DETEKTOR ELEKTRONOVÉHO ZÁCHYTU (ECD)

Detektor elektronového záchytu ECD využívá principu, že vodivost plynů v ionizační komůrce se dramatickým způsobem mění přítomností nebo absencí kontaminujících látek v plynu. ECD sestává z ionizační komůrky obsahující radioaktivní zdroj βzáření – nikl-63 (vyznačuje se dlouhou životností a stabilitou až do 450 °C) – a trysky přivádějící inertní plyn, obvykle dusík. β paprsky z ionizačního zdroje ionizují inertní plyn a vytváří tok volných elektronů. Tuto skutečnost popisuje rovnice (1):

Rovnice (1)

Ionizační cela je připojena ke zdroji nízkonapěťového potenciálu. Vložený potenciál způsobí migraci volných elektronů k anodě, nakteré jsou sebrány, a výsledkem je ustanovení rovnoměrného toku proudu. Pečlivým nastavením vloženého potenciálu se dosáhne ustanovení rovnovážného stavu, pomocí něhož všechny elektrony uvolněné v ionizačním procesu jsou sebrány na anodě. Mobilita volných elektronů je větší než pozitivně nabitých iontů, a proto než stačí dojít k rekombinaci, tak volné elektrony dospějí k anodě.

Proto je možné v komůrce v ustáleném stavu měřit konstantní proud. Prostor mezi zdrojem a anodou, ve kterém se pohybují volné elektrony, se nazývá jako oblast plasmy. Když se elektrofilní sloučenina dostane do detektorové cely, dojde k reakci mezi touto sloučeninou a volnými elektrony podle následujících rovnic (2,3):

Rovnice (2, 3)

V důsledku těchto reakcí rychle pohybující se elektrony jsou nahrazeny pomalými negativními ionty. Tyto pomalé ionty potřebují více času k tomu, aby se dostaly k anodě, a tak než k ní dospějí, je podstatně větší pravděpodobnost jejich rekombinace s kladně nabitými ionty než u elektronů. Při vstupu elektrofilní látky do detektoru tedy dojde k poklesu toku proudu v cele, což zařízení měřící proud zachytí jako vznikající pík.

Vzhledem k tomu, že volné elektrony se pohybují k anodě velmi rychle, možnost vzniku kolizních reakcí se snižuje. Proto je třeba volné elektrony zpomalit. K tomu se používá tzv. „make-up gas“, obvykle dusík. Pohyb elektronů je snižován pomocí nepružných srážek s elektrony (31).

3.1 Vliv teploty

Reakce mezi molekulami vzorku a volnými elektrony může probíhat dvěma způsoby – disociativně nebo nedisociativně (viz rovnice 2, 3). Při disociativním způsobu je zapotřebí značné energie k tomu, aby došlo k disociaci molekuly. Při zvýšení teploty detektoru se zvyšuje energie jak molekuly vzorku, tak elektronu a v důsledku toho disociativní reakce probíhá snadněji. Avšak při nedisociativním průběhu vzrůstá energie molekuly vzorku, která se rozprostře a vznikne stabilní komplex. Zvýšení teploty detektoru v tomto případě má za následek menší změnu v průběhu nedisociativní reakce.

Zjednodušeně řečeno, teplota detektoru může ovlivnit citlivost detektoru. Při nedisociativním způsobu pro dosažení maximální citlivosti je nutné použít co nejnižší teplotu detektoru, která je slučitelná s teplotou kolony. Při disociativní reakci vyšší teplota detektoru zvyšuje citlivost.

Druh probíhající reakce se dá jednoduše zjistit analýzou vzorku při různých teplotách detektoru. Podle dosažené odezvy je možné určit, za jaké teploty detektoru by měření mělo probíhat.

Příkladem uplatnění těchto dvou mechanizmů je stanovení vicinálních diketonů (diacetyl a 2,3-pentandion) a alifatických chlorovaných uhlovodíků v pivu. Na obr. 1 je vidět, jak se vzrůstající teplotou semění odezva pro tyto skupiny látek. Při detekci vicinálních diketonů se uplatňuje nedisociativní mechanismus a je tedy žádoucí nastavení nízké teploty detektoru, zatímco u alifatických chlorovaných uhlovodíků probíhá mechanizmus disociativní. Výsledky byly naměřeny v naší laboratoři na plynovém chromatografu Thermo Scientific TraceGC Ultra.

Obr. 1 Závislost odezvy diacetylu a chloroformu na teplotě ECD

3.2 Praktické poznámky

Pro dosažení vysoké citlivosti a selektivity je nutné při používání detektoru elektronového záchytu dodržet následující body:

• Teplota detektoru musí být vždy nastavena nad maximální teplotou teplotního programu kolonového termostatu, aby nedocházelo ke kondenzaci vzorku a/nebo stacionární fáze v detektoru.
• Vždy nastřikovat malé množství vzorku (ne více jak 1 nanogram v případě látek se silným zachytáváním elektronů). Detektor je tak citlivý, že tyto látky mohou detektor zahltit a saturovat až po několik hodin.
• Vždy je nutné udržovat vysoký průtok plynu skrz detektor (obvykle ne méně než 40–50 ml/min), aby bylo zajištěno vyplachování celého mrtvého objemu.
• Nikdy nevyhřívat chromatografickou kolonu nad maximální teplotu, která je doporučena pro stacionární fázi kolony. Vzhledem k velké citlivosti ECD, již malé množství stacionární fáze, které z kolony „vykrvácí“, povede k ztrátě citlivosti detektoru. Navíc fáze uvolněná z kolony v tomto typu detektoru neshoří jako v případě plamenoionizačního detektoru, ale zkondenzuje v ECD.
• Ztráta ustáleného proudu po každém nástřiku indikuje kontaminaci detektoru sloučeninami ze vzorku. V tom případě je vhodné vyčistit detektor vyhřátím na maximální teplotu (bez kolony) přes noc.
• Mnoho rozpouštědel může zachytávat elektrony (např. aceton, alkohol, ether nebo jakékoli chlorované rozpouštědlo). Nástřik i velmi malých množství těchto rozpouštědel může způsobit zahlcení ECD.
• Vzhledem k tomu, že nosný plyn a make-up plyn neustále proudí skrz detektor, jakákoli i sebemenší nečistota těchto plynů se rychle nahromadí v detektorové cele a sníží hodnotu ustáleného proudu. Z tohoto důvodu je nutné používat vysoce čisté plyny v kvalitě přímo určené pro ECD nebo plyny v obyčejné kvalitě dočišťovat pomocí speciálních filtrů.

4 PLAMENOFOTOMETRICKÝ DETEKTOR (FPD)

Plamenofotometrický detektor (FPD) byl poprvé popsán Grantem (32) v roce 1958. Základní princip plamenofotometrického detektoru vychází ze specifické emise světla o dané vlnové délce během shoření látky v plameni. Tento detektor se využívá k detekci sirných láteka sloučenin obsahujících fosfor.

Konec kapilární kolony ústí v trysce s plamínkem, kde se eluent mísí s vodíkem a shoří. Tryska s plamínkem je nastavena tak, aby světlo z plamínku dopadalo přímo do fotonásobiče. Blok s tryskou je vyhříván, aby se zabránilo kondenzaci. Světlo emitované nad plamínkem nejprve prochází dvěma filtry a pak přes filtr propouštějící jen danou vlnovou délku dopadá do fotonásobiče. Za správných podmínek při shoření látek obsahujících fosfor nebo síru vznikají HPO a S2, které poskytují charakteristické emise o vlnové délce 526 a 394 nm. Odezva detektoru na síru je prakticky nezávislá na změnách v nastavení průtoku vodíku. Odezva sloučenin s fosforem vykazuje maximum při určitém průtoku vodíku, nicméně se velmi mění s průtokem vzduchu.

4.1 Nelineární odezva

Největším problémem při používání plamenofotometrického detektoru je jeho kvadratická závislost odezvy v režimu měření síry. Tento jev se projeví např. při změně retenčního času při detekci velmi malého množství látky. U lineárních detektorů má prodloužení retenčního času za následek snížení velikosti píku a z toho důvodu se sníží i detekční limit. Při kvadratickém průběhu odezvy detektoru se však tento efekt násobí a při stanovování stopových množství může pík zaniknout v šumu.

Z tohoto důvodu je nutné věnovat pozornost faktorům ovlivňujícím šum detektoru. Nadměrný šum může způsobovat plamínek, což je důsledkem nesprávného nastavení průtoků jednotlivých plynů, použitím plynů nedostatečné čistoty nebo krvácením kolony způsobené jejím vyhřátím na příliš vysokou teplotu. Jiným zdrojem šumu může být trubice fotonásobiče, která je náchylná na kondenzaci vlhkosti, ke které může dojít při velkých změnách teploty nebo když plamínek není zapálen. Na začátku měření, když se začíná od vychladlého detektoru, je možné, že šum je poněkud větší. Během krátké doby by kondenzát však měl zmizet a šum by měl klesnout na normální úroveň (31).

5 ZÁVĚR

Vývoj plynové chromatografie v současné době není převratný. V oblasti detektorů se sice stále více rozšiřují nejrůznější typy speciálních hmotnostních detektorů, jejichž cena klesá, a tak se stávají dostupnějšími. Nicméně detektory FID, ECD a FPD jsou stále nejmasověji rozšířené a pro potřeby rutinních pivovarsko-sladařských stanovení plně dostačující.