N-nitrosaminy v 21. století
N-nitrosaminy: NDMA
Dusíkaté karcinogenní látky zvané N-nitrosaminy byly v pivu a sladu poprvé popsány v 70. letech dvacátého století. Jejich prokázaný obsah v pivu v kontextu s významným zdravotním rizikem vedl k vývoji nových technologických postupů, zejména přípravy sladu. Po jejich zavedení do praxe byly koncentrace N-nitrosaminů ve sladu a pivu značně sníženy, a proto zájem o výzkum těchto látek v posledních 15 letech ustoupil na minimum. A to i přes to, že mnohé otázky v této problematice nebyly dosud zodpovězeny. Tento článek je věnován stručnému historickému přehledu problematiky N-nitrosaminů a informuje o nejvýznamnějších dosažených pokrocích v analýze těchto sloučenin za posledních 15 let.
1 ÚVOD
Nitroso sloučeniny jsou látky, které obsahují ve své molekule kovalentně vázanou nitroso skupinu (-NO). Podle atomu, na který je tato skupina vázána, lze dále rozlišovat C-, N-, S- a O-nitroso sloučeniny. Tyto látky mohou vznikat přímým působením nitrosačních činidel na příslušné prekurzory nebo prostřednictvím transnitrosačních reakcí, kdy je nitroso skupina přesunuta z jedné molekuly na jinou (Wainright, 1986a). Nejvýznamnějšími nitrososloučeninami v potravinářství jsou N-nitrososloučeniny, konkrétně N-nitrosaminy. Sumárně lze tyto látky charakterizovat jako N-nitrosované sekundární aminy s obecnou strukturou R1(R2)N-NO, kde R1 a R2 jsou uhlíkaté zbytky, aromatické cykly, acyly či části heterocyklu. Na principu rozdílné tenze par se N-nitrosaminy, rozlišují na těkavé, málo těkavé a netěkavé. Do skupiny těkavých se zařazují látky s kratšími uhlovodíkovými řetězci nebo jednoduchými nesubstituovanými heterocykly, např.N-nitrosodimethylamin (NDMA). K málo těkavým se řadí například sekundární nitrosaminy, jejichž jeden nebo dva řetězce jsou tvořeny fenylovou skupinou např. N-nitrosomethylfenylamin (NMPhA) a N-nitrosoethylfenylamin (NEPhA). Naopak, netěkavé N-nitrosaminy obvykle obsahují polární skupiny nebo delší alkylové řetězce, a patří sem N-nitrosoamino kyseliny, N-nitrosované heterocyklické karboxylové kyseliny, N-nitrosomočoviny, N-nitrosoamidy a případně další dosud necharakterizované sloučeniny (Francis, 2000). Strukturní vzorce zástupců N-nitroso sloučenin jsou uvedeny na obr. 1.
Obr.1 Strukturní vzorce N-nitrosodimethylaminu (NDMA), N-nitrosopyrrolidinu (NPYR), N-nitrosoprolinu (NPRO) a N-nitrosomethylmočoviny (NMU))
Řada studií potvrdila, že N-nitrosaminy jsou látky silně karcinogenní a mutagenní (Tricker et al., 1991). Netěkavé N-nitrosaminy byly klasifikovány jako méně toxické, avšak jednoduchými cestami z nich mohou vznikat mnohem toxičtější těkavé N-nitrosaminy. Tyto látky se mohou vyskytovat v různých potravinách, zejména po jejich tepelném zpracování či po přídavku konzervačních solí (Francis, 2000). Jejich přítomnost byla prokázána v grilovaném mase (Kocak et al., 2012), v některých kosmetických přípravcích (Ma et al., 2011), tiskařských a tetovacích barvách (Laux et al., 2015), pryžových výrobcích (Speigelhalder et al.,1982), sušených rybách, uzeninách, v cigaretovém kouři a v neposlední řadě ve sladu a v pivu (Francis, 2000; Čulík et al., 1995).
Nejběžnější metodou stanovení N-nitrosaminů je plynová chromatografie s chemiluminiscenční (GC-TEA) nebo s hmotnostní (GC-MS) detekcí. Tyto metody jsou vhodné zejména pro těkavé a málo těkavé N-nitrosaminy, pro netěkavé N-nitrosaminy je nutná předchozí derivatizace. Metoda s využitím TEA detekce je sice velice selektivní a citlivá, má však také své nevýhody. Tím, že TEA detektor není zcela běžný, bývá poměrně komplikovaná jeho údržba a servis. Dalším problémem je malé spektrum potřebných standardů pro identifikaci a kvantifikaci, neboť dosud nebyly popsány a identifikovány zdaleka všechny struktury z široké řady těchto sloučenin (McWeeny et al., 1983).
Dosud neexistuje žádná rutinní a spolehlivá metoda pro stanovení netěkavých N-nitrosaminů. Proto se netěkavé N-nitrosaminy běžně stanovují spolu s těkavými N-nitrosaminy jako zdánlivá suma všech N-nitroso sloučenin, tzv. ATNC (z anglického Apparent Total N-nitroso Compounds), kde se celková suma vyjadřuje jako koncentrace N-nitroso skupiny v jednotkách μg (N-NO)/l resp.kg. Tato metoda je založena na kvantitativním štěpení N-NO vazby a detekci oxidu dusnatého, respektive nitrosyl bromidu pomocí chemiluminiscenční detekce. Tato metoda byla vyvinuta a přijata již v 70.letech, a od té doby nebyla nijak novelizována a dosud nebylo určeno, které konkrétní látky se na ATNC podílejí. Pouze na základě dřívějších studií je patrné, že netěkavé N-nitrosaminy tvoří převážnou většinu z celkového obsahu ATNC v pivu (Čulík et al., 2012a;2012b). Koncentrace ATNC v pivech se pohybují pod 20 μg (N-NO)/l. Řádově stovkové hodnoty zpravidla svědčí o mikrobiální kontaminaci v některé fázi pivovarského provozu (Olšovská et al., 2014).
Ve sladu vznikají N-nitrosaminy jako produkty reakcí sekundárních či terciárních aminoskupin s oxidy dusíku přítomných během hvozdění naklíčeného ječmene (Basařová et al., 2015). Prekurzorem NDMA ve sladu je zejména alkaloid hordenin, v menší míře také gramin a dimethylamin (Wainwright et al., 1986a). Mnohé N-nitrosaminy nevznikají primárně nitrosací příslušných aminů, ale vznikají z různých nitrosovaných či jiných sloučenin, které mohou poskytovat přímo N-nitrosaminy nebo jejich nenitrosované analogy. Například N-nitrosoprolin (NPRO) a N-nitrososarkosin (NSAR) při vyšších teplotách dekarboxylují za vzniku N-nitrosopyrrolidinu (NPYR) a NDMA (Pollock et al., 1981) nebo N-nitrosované heterocyklické karboxylové kyseliny se mohou tvořit nitrosací kondenzačních produktů aminokyselin (cystein, serin, threonin a tryptofan) s jednoduchými aldehydy (Francis, 2000).Látky s dvěma amino skupinami, které jsou odděleny čtyřmi nebo pěti uhlíkovými atomy, například aminokyselina lysin, či některé biogenní aminy, poskytují po N-nitrosaci cyklické N-nitrosaminy (Drabik-Markiewicz et al., 2011). Dalším významným prekurzorem N-nitrosaminů je kreatin, který se rozkládá na aminokyselinu sarkosin. Ten může být následně nitrosován (Wainright, 1986a) a jak již bylo výše uvedeno, může být termálně dekarboxylován na NDMA.
N-nitrosaminy mohou také vznikat z pesticidů, zejména ze skupiny dinitroanilinů. Kromě toho, že jsou některé pesticidy přímými prekurzory N-nitrosaminů, tak pesticidy samotné mohou být kontaminovány N-nitrosaminy, jakožto vedlejšími produkty jejich výroby (Bontoy-an et al., 1979).
Zdrojem N-nitrosaminů v pivu mohou být tedy všechny vstupující suroviny. Hlavním zdrojem je však v případě těkavých nitrosaminů zejména použitý slad, v případě ATNC bakteriální kontaminace piva či jeho meziproduktů. Vznik N-nitrosaminů během sladování byl v současnosti minimalizován, a to díky úpravě technologie hvozdění. Dalšími příznivými faktory jsou vysoký faktor ředění a jejich nízká extrahovatelnost do vody během vystírání a rmutování.
Jinak je tomu u dusitanových a dusičnanových iontů, které jsou ve vodě velice dobře rozpustné. Dusitanové ionty ve vodě tvoří v kyselém prostředí kyselinu dusitou a dále reagují na oxidy dusíku (nitrosační činidla), za vzniku N-nitrososloučenin. Jelikož česká legislativa povoluje maximální koncentraci dusitanů v pitné vodě 0,5 mg/l, kontaminace dusitany z varní vody téměř nehrozí. Horší situace je v případě dusičnanových iontů, které jsou ve vodě tolerovány do maximální koncentrace 50 mg/l a jejich obsah ve varní vodě může být ještě zvýšen chmelením (chmel je zdrojem vysokého obsahu dusičnanů). V případě mikrobiální kontaminace nitrát redukujícími bakteriemi může dojít k redukci dusičnanů na dusitany, ty již výše popsaným mechanismem reagují za vzniku N-nitrosaminů (Smith, 1992).
2 LEGISLATIVA
Podle metodických doporučení Českého svazu pivovarů a sladoven, vycházejících z požadavků kompendií JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives), které byly součástí dnes již zrušené vyhlášky č.305/2004, je požadované nejvyšší přípustné množství NDMA v pivu 0,5 μg/kg a sumy nitrosaminů (zahrnující NDMA, NDEA, NPYR, NPIP, NMOR a NDBA) 1,5 μg/kg. Pro obsah nitrosaminů ve sladu platí obdobné opatření, které činí 1 μg/kg v případě NDMA a 10 μg/kg v případě sumy těkavých nitrosaminů. V Německu je například doporučená hranice pro obsah NDMA ve světlém sladu 2,5 μg/kg (Čulík et al., 2011). Pro ATNC není uplatňována žádná zákonná hranice, ale většinou se hodnota kolem 20 μg (N--NO)/l považuje za uspokojivou.
3 POKROKY V ANALÝZE N-NITROSAMINŮ
Současným trendem v oblasti analýzy N-nitrosaminů je vysoce selektivní, avšak provozně velmi náročný chemiluminiscenční detektor nahradit za univerzálnější hmotnostně spektrometrický detektor. Většina nových metod stanovení N-nitrosaminů byla vyvinuta pro analýzu těchto látek především v masných produktech, tabáku, kosmetických výrobcích a pitné či odpadní vodě, kde mohou N-nitrosaminy vznikatjako vedlejší produkty dezinfekce (Nawrocki et al., 2011).
Pro přípravu kapalných vzorků (různé alkoholické nápoje, včetně piva) byl pro stanovení těkavých N-nitrosaminů vyvinut postup extrakce na pevné fázi s polymerním nosičem (Zhao et al., 2006;Ju rado-Sánchez et al., 2007), aktivním uhlím či kokosovým uhlím (Ngongang et al., 2015;Pozzi et al., 2011), a dále headspace mikroextrakce na pevné fázi (Lona-Ramirez et al., 2015). Pro pevné vzorky byly testovány pokročilé extrakční techniky jako je superkritická fluidní extrakce (Filho et al., 2007), mikrovlnná a ultrazvuková extrakce (Jurado-Sánchez et al., 2013) nebo mikroextrakce na pevné fázi za pomoci zařízení pro přímou extrakci (SPME-DED) z pevných vzorků, která umožňuje rychlý, jednoduchý a nedestruktivní screening těkavých N-nitrosaminů, a případně dalších těkavých toxických látek v potravinách (Ventanas et al., 2006). Po samotné úpravě je vzorek většinou separován pomocí plynové chromatografie, byly však také popsány některé metody využívající kapalinovou chromatografii, a topro stanovení tepelně stabilních i nestabilních těkavých nitrosaminů současně a redukci celkového času analýzy (Zhao et al., 2006). Tyto separační techniky jsou dále nejčastěji párovány s hmotnostně spektrometrickou detekcí, ať už v tandemovém uspořádání (Zhao et al.,2006;Qiang et al., 2011;Ripollés et al., 2011;Boyd et al., 2011) či s detektory s vysokým rozlišením pracující na principu orbitální iontové pasti (Ngongang et al., 2015; Krauss et al., 2008).
V současné době se problematikou analýzy netěkavých N-nitrosaminů v potravinách zabývá kolektiv autorů Národního potravinářského ústavu Technické dánské univerzity, kde byla vyvinuta metoda pro simultánní stanovení těkavých i netěkavých N-nitrosaminů v masných výrobcích pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí v kombinaci s ionizací za atmosférického tlaku a elektrospreje (Herrmann et al., 2014). Z netěkavých N-nitrosaminů byly sledovány především N-nitrososarkosin, N-nitrosohydroxyprolin, N-nitrosoprolin, N-nitroso-2-methyl-thiazolidin-4-karboxylová kyselina a N-nitrosothiazolidin-4-karboxylová kyselina (NSAR, NHPRO, NPRO, NMTCA a NTCA). Autoři studovali vlivy různých faktorů na výsledné koncentrace těkavých i netěkavých N-nitrosaminů v masných produktech, jako vliv teploty (Herrmann et al., 2015a) nebo množství přidaného dusitanu a erythorbové kyseliny a askorbil palmitátu jako inhibitorů nitrosace (Herrmann et al., 2015b).
Dnes již klasická, avšak časově náročná a pracná, metoda stanovení ATNC pomocí denitrosační směsi bromovodíku a ledové kyseliny octové byla porovnávána s metodami využívající jiná denitrosační činidla. Jedna z metod využívá k denitrosaci směs jodu a jodidu draselného v kyselém prostředí (Kulshrestha et al., 2010). Další z těchto metod využívá denitrosace pomocí směsi chloridu měďného a kyseliny chlorovodíkové. Autoři této metody využili aparatury, skládající se z komerčně dostupné jednokusové reakční nádoby, která umožnila výrazné zjednodušení této metody a snížila případné problémy spojené s relativně velkou aparaturou původní metody (Wang et al., 2005). Tyto metody však byly dosud aplikovány pouze na masné výrobky, sójovou omáčku a pitnou a bazénovou vodu.
4 NOVODOBÉ POZNATKY O VLASTNOS-TECH N-NITROSOSLOUČENIN
Vlastnosti N-nitrosaminů nejsou dosud zcela prozkoumány, avšak v uplynulých letech bylo dosaženo řady významných poznatků. K nim bezesporu patří studie kvantitativních vztahů mezi strukturou molekuly a její karcinogenní aktivitou (QSAR – Quantitative Structure-Activity Relationships) (Helguera et al., 2008). Z této studie vyplývá vliv substituentů v poloze R1 a R2 u symetrických a asymetrických N-nitrosaminů se základní strukturou R1(R2)N-NO a také vliv substituentů u N-nitrosomočovin na karcinogenní aktivitu dané molekuly. Kladný příspěvek k celkové karcinogenní aktivitě N-nitrosaminů mají zejména nesubstituované alkylové zbytky, a naopak záporného příspěvku dosahují nenasycené řetězce či uhlovodíkové fragmenty substituované polárními skupinami. U N-nitrosomočovin je situace poněkud složitější. Závisí zde jak na typu substituentu, tak na jeho poloze v řetězci. Obecně však opět platí, že látky s polárnějšími substituenty mají menší karcinogenní aktivitu. Zároveň je z tohoto kvantitativního modelu patrné, že u N-nitrosomočovin nejvíce přispívá k celkové karcinogenní aktivitě samotná základní centrální struktura N-C(O)-N-NO, substituenty nejsou příliš rozhodující. Tyto závěry jsou v souladu s teorií biotransformace xenobiotik v lidském organismu a teorií metabolické aktivace nitrosaminů, které předpokládají, že hydrofilní látky tělo může přímo beze změny vyloučit, a proto nehrozí takové riziko toxického účinků, zatímco látky lipofilní musí být metabolicky přeměněny na hydrofilní (Lüllmann et al., 2007) a touto metabolickou přeměnou dochází k aktivaci karcinogenních vlastností nitrosaminů a jejich interakci s DNA (Kushida et al., 200). Přestože tedy nitrosaminy s polárními skupinami vykazují malé nebo nulové karcinogenní účinky, mohou být v trávicím traktu transnitrosovány na mnohem toxičtější nitroso sloučeniny (Inami et al., 2015; Inami et al., 2013).
Autoři Yurchenko a kol. publikovali zajímavou studii zabývající se vztahem mezi koncentrací NDMA a objemovým procentem alkoholu v pivu (Yurchenko et al., 2005), kdy podle jejich výzkumu koncentrace NDMA klesá s rostoucím obsahem alkoholu. Tato závislost byla studována na různých typech estonských piv a nalezena byla také napříč světlými pivy z různých evropských zemí. Autoři tento jev vysvětlují inhibičním efektem ethanolu na nitrosační reakci, která byla popsána již v 80. letech dvacátého století (Wainright, 1986a). Autoři Yurchenkoa kol. zároveň poukazují i na vyšší koncentrace NDMA v tmavých pivech, což je následek obecně vyššího zastoupení dimethylaminu v tomto druhu piv (Yurchenko et al., 2005). Tento závěr je poněkud spekulativní, zásadní vliv na koncentraci NDMA v tmavých pivech má složení sypání, kdy se používá vyšší podíl mnichovského sladu.
Zvýšený vznik nitroso sloučenin je často podmíněn mikrobiální kontaminací. Současně lze v takto kontaminovaném pivu nalézt látky nazývané biogenní aminy, které jsou považovány za prekurzory N-nitrosaminů a jejich vznik byl studován za různých experimentálních podmínek (Drabik-Markiewicz et al., 2011). Studována byla také korelace mezi přirozeným logaritmem koncentrace ATNC a biogenních aminů v pivech a ze získaných dat nebyl prokázán vztah mezi koncentrací NDMA a celkovými ATNC (Olšovská et al., 2014;Čulík et.al., 2012a). Jak již bylo popsáno dříve, látky podílející se na celkové hodnotě ATNC nejsou z velké většiny dosud charakterizované, avšak z principu klasické bromovodíkové metody stanovení ATNC vyplývá, že konkrétně sloučeniny s N-nitroso skupinou nemusejí být jedinými zástupci této skupiny látek. Dalšími látkami mohou být zejména sloučeniny s C-nitroso skupinou v molekule. Různé C-nitroso sloučeniny byly již studovány, avšak dosud nebyly žádné z nich identifikovány v pivu či jeho surovinách. Publikován byl však mechanismus C-nitrosace polyfenolů, jako je katechin, epikatechin, prokyanidin B1, B2 a B5 za kyselých podmínek v přítomnosti dusitanových iontů (Hirota et al., 2015). Tyto a další podobné látky jsou přirozenou součástí chmele a sladu a přecházejí do roztoku během procesu výroby piva (Olšovská et al., 2015), proto lze předpokládat, že takovéto C-nitrosované polyfenoly mohou tvořit část ATNC.
5 N-NITROSAMINY V PIVU A SLADU ZA POSLEDNÍCH 15 LET
Od roku 1977 průměrná koncentrace NDMA v pivech i sladech postupně klesá (Lachenmeier et al., 2007) a výskyt vzorku s výrazně vyšší hodnotou je zcela ojedinělý. V takovém případě zvýšený obsah NDMA pružně signalizuje závadu v technologickém procesu či náhlý výskyt mikrobiální kontaminace. Tento stav lze doložit výsledky Analytické zkušební laboratoře Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského. V období let 2001 až 2015 byly těkavé N-nitrosaminy stanoveny celkem u 4115 vzorků ječných sladů z komerčních sladoven a u 1280 vzorků piv z malých i velkých pivovarů, což je průměrně 274 vzorků sladu a 85 vzorků piv ročně.
Do vyhodnocení byly zahrnuty vzorky plzeňských i mnichovských sladů tuzemské i zahraniční výroby (zejména z Polska, Slovenska, Rumunska a Srbska) a vzorky světlých i tmavých, alkoholických i nealkoholických piv (především z České republiky). Zastoupení mnichovských sladů, které běžně dosahují vyšších koncentrací NDMA než slady plzeňské, bylo napříč studovaným časovým obdobím téměř konstantní a pohybovalo se okolo 15 %. Ostatní těkavé N-nitrosaminy byly ve vzorcích detekovány jen ve výjimečných případech a šlo především o N-nitrosopyrrolidin a N-nitrosodiethylamin.
Střední hodnoty naměřených koncentrací NDMA ve sladech a v pivech jsou pomocí sloupcového grafu znázorněny na obr. 2. Tyto hodnoty jsou u piva pod mezí stanovitelnosti dané analytické metody, která pro NDMA činí 0,2 μg/kg, kromě dat z roku 2006. U vzorků sladu se tyto hodnoty stabilně pohybují okolo 0,8 μg/kg, kromě výchylek v letech 2001 až 2003 a 2006.
Obr.2 Střední hodnoty koncentrací NDMA v jednotlivých letech
Procento vzorků převyšující v jednotlivých letech mez 0,5 μg/kg u vzorků piv a 2,5 μg/kg u vzorků sladů je znázorněno na obr. 3. Tyto mezní hodnoty byly vybrány na základě požadavku na obsah NDMA v pivu, a nejvyšší koncentraci NDMA doporučovanou německými úřady ve sladu (viz oddíl 2 Legislativa), protože přísnější hodnotu doporučovanou Českým svazem pivovarů a sladoven (1 μg/kg) převyšovalo 30 – 60 % vzorků sladu. Z grafu je patrný mírný pokles procenta vzorků sladu s obsahem NDMA nad 2,5 μg/kg (s vyloučením hodnotyz roku 2001, kde bylo analyzováno výrazně méně vzorků než v ostatních letech) a ustálení okolo 6 % v posledních 5 letech. Na obr. 4 jeznázorněna závislost mezi procentem vzorků sladu s koncentrací nad 2,5 μg/kg a rokem stanovení, výsledný Pearsonův korelační koeficientje roven -0,81, což značí vysokou míru asociace. Zvýšená koncentrace NDMA ve vzorcích piv (nad 0,5 μg/kg) je v posledních letech spíše náhodná, předpokládáme, že většinou byla způsobena bakteriální kontaminací nebo použitím kontaminovaného sladu.
Obr.3 Procento vzorků vyšších než 0,5 μg/kg u piva a 2,5 μg/kg u sladu
Obr.4 Korelace mezi procentem vzorků sladu s koncentrací nad 2,5 μg/kg a rokem stanovení
6 ZÁVĚR
V posledních letech byla v oblasti tématiky N-nitrosamů věnována pozornost především takovým matricím jako jsou masné výrobky, tabák či voda. Tyto látky, zejména těkavé N-nitrosaminy, jsou stále předmětem pozornosti díky své vysoké toxicitě, a proto je nutno sledovat jejich obsah na základě platné legislativy. Také ve studiu netěkavých N-nitrosaminů došlo k pokroku, byly vyvinuty nové metody jejich identifikace a stanovení a byly úspěšně aplikovány na masných výrobcích.
Od 70. let 20 století, kdy byl úspěšně vyřešen problém s vysokými koncentracemi těkavých N-nitrosaminů ve sladu a v pivu, nebylo v této oblasti kromě převedení TEA detekce na MS detekci učiněno žádných nových pokroků. Je potřeba si však uvědomit, že technologické kroky při výrobě sladu minimalizující vznik NDMA nemusejí zcela zabránit vzniku některých netěkavých N-nitrosaminů, například NPRO (Wainwright, 1986b;Smith, 1994). Vlastnosti, toxické účinky a mechanismus vzniku netěkavých N-nitrosaminů nebyly dosud dostatečně prostudovány (kromě NPRO a NSAR), i když je jejich přítomnost v některých potravinách a nápojích včetně piva jasně prokázána (Johnson et al., 1987). Jelikož netěkavé N-nitrosaminy tvoří významný podíl ATNC, nemusí být nízká koncentrace těkavých N-nitrosaminů automaticky brána jako uspokojivá situace. Hladiny ATNC v pivu se ve většině případů pohybují pod hranicí 20 μg (N--NO)/l, což je jistě oproti minulosti významný pokles (Massey et al.,1987). Přesto celková suma ATNC může obsahovat podíl toxických netěkavých N-nitrosaminů, o kterých zatím nic nevíme, neboť je nejsme současnými metodami schopni detekovat. Pokud takové látky byly prokázány v masných výrobcích, mohou se vyskytovat takév pivu. A ač je jejich koncentrace relativně nízká, jejich příjem do našeho těla spolu s pravidelnou konzumací piva může znamenat určité riziko. Přestože nebyly některé dosud známé netěkavé N-nitrosaminy označeny za karcinogeny jako jejich těkavé analogy, ukázalo se, že i tyto látky mohou nepřímo prostřednictvím transnitrosace v trávicím traktu přispívat ke vzniku nádorového onemocnění (Inami et al.,2013;2015). Proto je zapotřebí vyvinout nové analytické metody zejména pro identifikaci a stanovení látek přispívající k celkové hodnotě ATNC v pivu ale i sladu. Na základě této identifikace by bylo možné posoudit zdravotní riziko občasných zvýšených hodnot ATNC v pivu.
Proto byl v Analytické zkušební laboratoři Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského, a.s., kde má problematika N-nitrosaminů dlouholetou tradici, zahájen nový výzkumný úkol zabývající se problematikou netěkavých N-nitrosaminů, jejich vztahem k hodnotě ATNC a příčinami jejich vzniku. K řešení úkolu bude využito nové špičkové instrumentální vybavení laboratoře a zcela nové postupy pro přípravu tuhých i kapalných vzorků.