Rychlejší plynová chromatografie a její využití v pivovarství. Část 1. - Teoretické a praktické aspekty

Na laboratoře jsou kladeny stále vyšší nároky jak z hlediska množství změřených vzorků, tak efektivnějšího využití nákladné instrumentace a rychlého získání požadovaných výsledků. Jedním ze způsobů, jak se vyrovnat s těmito nároky, je použití rychlejší plynové chromatografie.

1 ÚVOD

Zájem o rychlejší plynově chromatografickou separaci se datuje už k počátku plynové chromatografie. Koncept chromatografie plyn-kapalina představili Martin a Synge v roce 1941 (1). V praxi ji poprvé použili James a Martin v roce 1952 (2,3). V roce 1957 Golay poprvé navrhl použít v plynové chromatografii kapilární kolony s tenkým filmem (4,5).

Už na začátku rozvoje plynové chromatografie bylo zřejmé, že cesta ke zrychlení separace spočívá v miniaturizaci. Miniaturizací je myšleno zmenšení velikosti částic v případě náplňových kolon nebo zmenšení vnitřního průměru v případě kapilárních kolon. Navíc toto zmenšení umožňuje ještě zkrátit i délku kolony, aniž by došlo ke zhoršení výstupního rozlišení, a tak dalším způsobem podpořit zrychlení chromatografické analýzy. Použití kapilární kolony v rychlé plynové chromatografii poprvé popsali Desty a kol. v roce 1962 (6).

Další rozvoj rychlé plynové chromatografie byl však zpomalen. Pravděpodobně z toho důvodu, že kapilární kolony se vyznačovaly velkým rozlišením (7), a výzkum se zaměřoval především na analýzy komplexnějších směsí; doba analýzy a selektivita nebyly hlavním předmětem výzkumného zájmu. Ke zpomalení rozvoje rychlé plynové chromatografie přispěl i nedostatek vhodné instrumentace. Situace se začala měnit až koncem sedmdesátých let a hlavně v průběhu osmdesátých let minulého století. Zatím nejrychlejší chromatografický záznam na kapilární koloně dosáhl Van Es a kol. (8) v roce 1988. Podařilo se jim rozdělit 9 uhlovodíků za pouhých 0,6 s, a to na koloně dlouhé 30 cm s vnitřním průměrem 50 μm. Od devadesátých let vývoj rychlé chromatografie pokročil díky novým způsobům umožňujícím rychlejší ohřev kolon.

2 DEFINICE RYCHLEJŠÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

V minulosti byl pojem rychlé nebo rychlejší plynové chromatografie již mnohokrát diskutován (9–14). Rozhodujícím faktorem při posuzování rychlé chromatografie je samozřejmě rychlejší získání analytických výsledků. Nicméně definice založené výhradně na době trvání chromatografické analýzy opomíjejí taková důležitá hlediska, jako je separace jednotlivých píků a kapacita píků. Jinými slovy, špatná separace tří píků během jedné minuty je silně neuspokojivá ve srovnání s rozdělením patnácti píků až na základní linii během téhož časového intervalu. Ačkoliv obě analýzy trvají pouze 1 min, druhá analýza poskytuje mnohem větší separační účinnost během téže doby. Proto je důležité použít definici, která bude zohledňovat i účinnost separace v čase. Z tohoto důvodu se jeví jako rozumné použít definici založenou na šířce píků.

V tab. 1 je uvedena závislost šířky píku na vnitřním průměru kapilární kolony. Z této tabulky je vidět, že pro rychlejší chromatografii hovoří menší vnitřní průměry kolony. Přitom v tomto příkladu byl zachován stejný počet teoretických pater u všech kolon. Jak vyplývá z tab. 1, při změně kolony o vnitřním průměru 530 μm na kolonu s vnitřním průměrem 100 μm dojde přibližně k devítinásobnému zúžení píků při stejném rozlišení a stejné kapacitě píků. To odpovídá asi devítinásobně rychlejší chromatografické analýze bez zhoršení rozdělení. Tento přístup, který umožňuje porovnávat chromatografické separace, je tedy založený jak na kvalitě rozdělení jednotlivých látek, tak na absolutní rychlosti analýzy (15).

Tab.1 Šířka píků jako funkce vnitřního průměru kolony. (Všechny kolony měly stejný počet teoretických pater.) (15)

3 INSTRUMENTACE PRO RYCHLEJŠÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFII

3.1 Nosný plyn a jeho regulace

Výběr nosného plynu má velmi podstatný vliv na rychlost chromatografické analýzy (16-18). V kapilární plynové chromatografii se nejčastěji používá helium, dusík, vodík nebo argon. Nesporná výhoda helia spočívá v tom, že se dá použít v kombinaci se všemi typy detektorů, včetně hmotnostních. Z tohoto důvodu jde o nejpoužívanější nosný plyn. Helium a dusík jsou netoxické, nehořlavé a i proto velmi bezpečné. Na druhé straně cena helia je podstatně vyšší než cena ostatních nosných plynů. Vodík vytváří se vzduchem výbušnou směs, proto z bezpečnostního hlediska může být používání vodíku poněkud rizikové. Oproti heliu a dusíku poskytuje vodík významné výhody v rychlosti analýzy, citlivosti a rozlišení na jednotku času (13). Porovnání relativních rychlostí analýzy založené na publikovaných datech pro tyto nejpoužívanější plyny uvádí tab. 2.

Tab. 2 Porovnání relativních rychlostí proudění různých nosných plynů (doba analýzy je nepřímo úměrná rychlosti proudění nosného plynu) (13)

Účinnost chromatografické kolony se dá vyjádřit počtem teoretických pater (N) nebo výškovým ekvivalentem teoretického patra (H =L/N, kde L je délka kolony). Výškový ekvivalent teoretického patra je funkcí průměrné lineární rychlosti nosného plynu (ū), kterou pro kapilární kolony popisuje Golayova-Giddingsova rovnice (5,19). Tato závislost je funkcí průměru kolony (dc), tloušťky stacionární fáze (df), kapacitního faktoru (k) a difúzních koeficientů analytu v mobilní a stacionární fázi. Pro danou kolonu a daný analyt získáme pro různé plyny (vodík, dusík, helium) tři různé křivky (obr. 1).

Obr. 1.

Z těchto závislostí vyplývají následující důležité skutečnosti (20):

a) Pro všechny nosné plyny je minimální hodnota H prakticky nezávislá na typu nosného plynu. Z toho plyne, že za předpokladu nastavení optimální průměrné rychlosti nosného plynu všechny tři plyny poskytují srovnatelnou účinnost arozlišení.

b) Optimální rychlost plynu je nejvyšší pro vodík ve srovnání s heliem nebo dusíkem. Pro standardní kapilární kolony (délka 10–50 m, vnitřní průměr 0,25–0,32 mm a tloušťka filmu 0,1–0,5 μm) při optimální rychlosti je vodík 1,5 krát rychlejší než helium a 3,3 krát rychlejší než dusík, přičemž výškový ekvivalent teoretického patra je přibližně stejný.

c) Strmost křivek klesá v pořadí dusík – helium – vodík. To znamená, že pokud použijeme dusík při práci s vyšší rychlostí plynu, než je rychlost optimální, dochází k rychlému poklesu účinnosti. Naopak, v případě vodíku lze rychlost plynu zvýšit bez výrazné ztráty účinnosti. Helium, jak je patrné z obrázku, má střední strmost. Strmost těchto křivek je významná pro rychlou plynovou chromatografii. Při zmenšování průměru kolony totiž klesá strmost této křivky, křivka se stává plošší a zvyšuje se hodnota optimální rychlosti. V důsledku je tedy možné zvyšovat rychlost nosného plynu bez výrazného snížení účinnosti.

Pokud se k detekci používají detektory citlivé na hmotnostní tok, jako je plamenoionizační detektor (FID) nebo termoionizační detektor (NPD), citlivost je závislá na množství analytu, které se dostane do detektoru za jednotku času. Dříve eluující pík se projeví vyšší citlivostí než později eluující širší pík. Z tohoto důvodu rychlá plynová chromatografie v kombinaci s vodíkem jako nosným plynem poskytuje nejvyšší citlivost.

Navzdory těmto nesporným výhodám se vodík jako nosný plyn běžně nepoužívá. Hlavní příčinou je skutečnost, že se vzduchem vytváří výbušnou směs. Ve skutečnosti je však riziko exploze velmi nízké. Jednak je velmi nepravděpodobné prasknutí pružných křemenný chkapilárních kolon a navíc průtoky nosného plynu se pohybují v řádu ml/min, a tudíž pravděpodobnost nahromadění vodíku v koncentraci vyšší než kritické je mizivá. Navíc vodík se vyznačuje velmi rychlou difúzí. Moderní chromatografy jsou vybaveny elektronickou kontrolou průtoku plynu, která umožňuje vypnutí přívodu plynu, pokud dojde k poklesu tlaku. Kromě toho jsou dnes k dispozici generátory vodíku, které eliminují nebezpečí plynoucí ze skladování a manipulace s vodíkovými tlakovými lahvemi.

Elektronická kontrola tlaku se také významným způsobem podílí na zkrácení doby analýzy. Viskozita plynu se totiž zvyšuje se vzrůstající teplotou (při použití teplotního programu), a tak dochází k poklesu průtoku plynu v koloně a tedy i k prodloužení doby analýzy, snížení odezvy detektoru a ztrátě účinnosti, pokud se rychlost dostane pod optimální rychlost (21). Elektronická kontrola tlaku umožňuje plynule měnit tlak na hlavě kolony, a tak pracovat s konstantním průtokem plynu během celé analýzy, a to i při teplotním programu pece.

Pro regulaci tlaku je u rychlejší a zejména u rychlé plynové chromatografie důležitá možnost nastavit maximální výstupní tlak z regulátoru na dostatečně vysoké hodnoty. Vzhledem k tomu, že se v rychlé plynové chromatografii používají velmi tenké kolony s vnitřním průměrem 0,1 mm nebo dokonce menším, je zapotřebí podstatně vyšší tlak na dosažení optimální rychlosti proudění plynu kolonou ve srovnání s konvenčními kolonami. Při práci v modu konstantního průtoku je důležitým kritériem elektronické regulace kontroly tlaku i maximální rychlost nárůstu tlaku. To bývá často problém použité instrumentace, proto se v rychlé plynové chromatografii většinou pracuje při konstantním tlaku (22).

3.2 Parametry chromatografických kolon

Rychlost plynově chromatografické analýzy lze významně ovlivnit délkou, průměrem a tloušťkou filmu stacionární fáze kapilární kolony.Zkrácení délky kolony představuje nejjednodušší způsob, jak zkrátit čas analýzy. Vzhledem k tomu, že počet teoretických pater je přímoú měrný délce kolony, tak tento postup lze aplikovat pouze v případě, že je možné akceptovat nižší účinnost kolony. Zkrácením kolony totiž dochází ke snížení separační účinnosti kolony.

Jak vyplývá z teorie rychlé plynové chromatografie, tak podstatně účinnějším způsobem zrychlení analýzy je použití kolony s menším průměrem (13). Jelikož počet teoretických pater je nepřímo úměrný vnitřnímu průměru kolony, tak zmenšením vnitřního průměru se zvýší separační účinnost kolony (23). To znamená, že při zmenšení průměru kolony na polovinu se počet teoretických pater zvýší dvojnásobně. Např. kolona s průměrem 50 μm a délkou 5 m má stejný počet teoretických pater jako kolona s průměrem 250 μm a délkou 25 m (24). Při snížení vnitřního průměru kolony je tedy možné zkrátit délku kolony a zrychlit tak analýzu, aniž by došlo ke ztrátě separační účinnosti.

Hodnota lineární rychlosti nosného plynu je dalším parametrem, který lze s výhodou využít ke zrychlení analýzy. Při snižování vnitřního průměru kolony klesá strmost H – ū křivky, která se zplošťuje, a díky tomu se zvyšuje hodnota optimální rychlosti. Z tohoto důvoduje možné zvyšovat rychlost nosného plynu, aniž by došlo k výraznému zhoršení účinnosti. Některé typické hodnoty pro helium jsou uvedené vtab. 3 (22). V důsledku toho je možné použít vyšších rychlostí, než je optimální, a pokles účinnosti je podstatně menší, než při použití kolon s větším vnitřním průměrem.

Tab. 3 Vliv vnitřního průměru kapilární kolony na délku kolony L (při stejném počtu teoretických pater n=100 000) a průměrnou rychlost nosného plynu ū pro helium (22)

Zmenšováním vnitřního průměru kolony však dochází ke snižování kapacity kolony. Pro běžné analýzy je použitelný nejmenší vnitřní průměr 0,050 mm. Ještě tenčí kapilární kolony již mají příliš malou kapacitu a nejsou vhodné pro rutinní analýzy (25,26).

3.3 Teplotní program

V rychlé chromatografii je důležitým parametrem také rychlost ohřevu chromatografické pece a její následné ochlazení umožňující zahájení další analýzy. Vzhledem ke krátké době analýzy je zapotřebí vyšších rychlostí ohřevu pece. Moderní plynové chromatografy umožňují vyhřátí pece rychlostí 50–100 °C/min. V konvenčních chromatografech rychlému ohřevu brání velký objem pece. Proto, aby se podařilo zrychlit ohřev, se vkládá do pece izolační polštář zmenšující objem pece (27). Tímto způsobem však nelze zvýšit rychlost ohřevu razantním způsobem. Pro velmi rychlé programování teploty se používají nekonvenční topná zařízení. Kapilární kolona se umisťuje do kovovétrubice, která je odporově vyhřívaná a umožňuje bleskový a přitom reprodukovatelný nárůst teploty rychlostí až 100 °C/s.

Tato přídavná topná tělesa se vyznačují nízkou teplotní kapacitou, proto jejich zchlazení na počáteční teplotu je poměrně rychlé (z 300 °C na 50 °C za méně než 30 s) (28,29). V případě konvenčních chromatografů je možné využít kryochlazení pomocí stlačeného oxidu uhličitého nebo dusíku.

3.4 Detektory

V celém systému instrumentace při rychlejší a zejména pak rychlé chromatografii je důležité, aby detektor nepřispíval k rozšiřování chromatografické zóny, a tak ve svém důsledku nesnižoval účinnost kolony. Kritickým parametrem z tohoto hlediska je objem cely detektoru. Pokud by byl příliš velký, docházelo by k výraznému rozšiřování zóny a v konečném důsledku ke snižování meze detekce.

U detektorů citlivých na hmotnostní průtok, jako je např. v pivovarské analytice nejpoužívanější plamenoionizační detektor (FID), kde mrtvý objem je v tomto případě prostor mezi koncem kolony a plamenem detektoru, se problém řeší pomocí zvýšeného průtoku přídavného plynu, aniž by docházelo k negativnímu ovlivnění meze detekce.

Dalším typem detektoru, používaným při rozborech piva, např. při stanovení vicinálních diketonů, je detektor elektronového záchytu (ECD). Ten se chová jako koncentrační detektor, proto je důležité, aby cela byla co nejmenší. Na druhé straně u tohoto detektoru je nutné, aby se vysoko energetické elektrony emitované β-zářičem mohly srazit s molekulami nosného plynu a mohly tak vzniknout sekundární elektrony s nižší energií. Proto musí být vždy zachována určitá vzdálenost mezi anodou a katodou. Pro tento účel byly zkonstruovány mikro-ECD detektory (22).

Hmotnostní detektory představují další skupinu detektorů, která nabývá na významu. Slouží nejen ke kvantifikaci, ale také k identifikaci a potvrzení látek. Přispívají i ke zrychlení analýzy, zejména v kombinaci s dekonvolučními technikami. Pro skenující detektory, jako jsou kvadrupolové hmotnostní detektory nebo iontové pasti, je v plném scanu možné získat maximálně 10–20 spekter/s. To je na hranici použitelnosti pro rychlou chromatografii. Proto je nutné při rychlé chromatografii použít neskenující hmotnostní detektory typu time-of-flight. Tyto detektory totiž umožňují až 500 plných spekter/s (30).

Další nároky v oboru rychlé chromatografie jsou v souvislosti s detektory kladeny na rychlost elektroniky, přesněji řečeno na dostatečně velkou vzorkovací frekvenci. K dobrému popsání chromatografického píku je zapotřebí minimálně 20 bodů (31,32). Vzhledem k tomu, že v rychlé chromatografii jsou píky velmi úzké, je tento požadavek kritický. Například pro šířku píku 50 ms je nutná frekvence sběru dat 200 Hz. S tím se zároveň značně zvětšuje objem získaných dat, který je při současné úrovni výpočetní techniky bez obtíží zpracovatelný.

4 ZÁVĚR

V článku je ukázán vliv průměru chromatografické kolony a typu nosného plynu na rychlost plynově chromatografické analýzy. Využitím velmi tenkých kolon v kombinaci s vodíkem jakožto nosným plynem a použitím elektronické regulace tlaku nosného plynu a dále termostatů s mimořádně rychlým ohřevem lze výrazným způsobem zkrátit dobu analýzy. Jako detektory lze použít plamenoionizační detektor s přídavným plynem eliminující ztrátu citlivosti v důsledku roz-mytí píků nebo mikro-ECD detektor. Detektory musí být vybaveny elektronikou umožňující dostatečně rychlý sběr dat.