Rychlejší plynová chromatografie a její využití v pivovarství. Část 3. - Stanovení vybraných semivolatilních senzoricky aktivních látek v pivu.

Použití křemenných kapilárních kolon s novým rozměrem vnitřního průměru 0,18 mm umožňuje zkrátit dobu plynově chromatografické analýzy, aniž by došlo ke zhoršení účinnosti separace. Předložená studie se zabývá využitím těchto kolon v porovnání s běžně používanými kolonami o vnitřním průměru 0,32 mm při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu, jako jsou mastné kyseliny (kyselina isomáselná, máselná, isovalerová, valerová, kapronová, kaprylová, pelargonová, kaprinová, laurová, myristová, palmitová, stearová, olejová, linolová, linoleová) a některé vyšší alkoholy. Tyto látky byly z matrice vyextrahovány extrakcí na pevné fázi nebo extrakcí v systému kapalina-kapalina po destilaci s vodní párou. K detekci byl použit plamenoionizační detektor.

1 ÚVOD

Urychlení celého analytického postupu při stanovení konkrétních látek je cílem prakticky všech laboratoří. Za tímto účelem se vyvíjejí nejenom jednodušší, rychlejší, a pokud možno i levnější postupy pro přípravu vzorku, ale také i metody vlastního stanovení.

Pro stanovení senzoricky aktivních látek v pivu, jako jsou mastné kyseliny nebo vyšší alkoholy, se s výhodou používají plynově chromatografické metody. Před vlastním plynově chromatografickým stanovením je však nutné sledované látky z piva vyextrahovat, zakoncentrovat a případně odstranit interferující látky. K tomu se často používají destilační metody s následnou extrakcí destilátu organickým rozpouštědlem (1,2) nebo přímo extrakce v systému kapalina-kapalina (3). Tyto především časově náročné postupy přípravy vzorků lze úspěšně nahradit extrakcí na pevné fázi (4,5), mikroextrakcí na pevné fázi (6-9) nebo extrakcí na míchací tyčince (10).

Jinou možností zkrácení celkové doby analytického stanovení je urychlení plynově chromatografické separace využitím rychlejší plynové chromatografie. Předcházející články popisovaly teoretické možnosti použití rychlejší plynové chromatografie a jejího praktického uplatnění při stanovení těkavých senzoricky aktivních látek v pivu (11,12). K tomu byla využita kolona s novým rozměrem vnitřního průměru 0,18 mm, kterou je možné použít ve spojení se stávajícím vybavením plynových chromatografů. Pracovní podmínky na těchto velmi tenkých kolonách lze velmi jednoduše získat „přeložením“ podmínek na stávající konvenční koloně pomocí „překladového“ software (13,14).

Tato práce se zabývá aplikací chromatografické kolony o vnitřním průměru 0,18 mm pro stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu, jako jsou nižší mastné kyseliny (kyselina isomáselná, máselná, isovalerová, valerová, kapronová, kaprylová, pelargonová, kaprinová), vyšší mastné kyseliny ve formě jejich methylesterů (kyselina laurová, myristová, palmitová, stearová, olejová, linolová, linoleová) a některé vyšší alkoholy. Pracovní podmínky a výsledky těchto nových metod včetně časových úspor jsou porovnány s charakteristikami metod získaných na konvenčních kapilárních kolonách o vnitřním průměru 0,32 mm.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0, syntetický vzduch byly dodány firmou Messer, ČR. Analýzy probíhaly na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 s nástřikem v dělícím modu a plamenoionizačním detektorem. Chromatograf byl osazen automatickým dávkovačem vzorků Labio ASG 40. Chromatografické kolony a pracovní podmínky pro jednotlivé druhy analýz jsou uvedeny dále v textu.

Kyseliny isomáselná, máselná, isovalerová, valerová, kapronová, heptanová, kaprylová, pelargonová, kaprinová, laurová, tridekanová, myristová, pentadekanová, palmitová, heptadekanová, stearová, olejová, linolová, linoleová, ethylhexanol, furfurylalkohol, ß-fenylethanol, 4-ethylfenol byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich, USA. Derivatizační činidlo boron trifluorid – 10% v methanolu bylo získáno od firmy Aldrich, USA. Hexan, dichlormethan od firmy Merck, Německo. Vzorky piva byly z maloobchodní sítě.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro analýzu senzoricky aktivních látek v pivu, jako jsou mastné kyseliny nebo vyšší alkoholy, se často používají kolony o délce 30 až 60 m s velmi vysokým počtem teoretických pater, aby bylo dosaženo uspokojivého rozlišení. V naší laboratoři se mastné kyseliny stanovují ve dvou analýzách. Nejprve nižší mastné kyseliny jako volné a dále pak vyšší mastné kyseliny ve formě jejich methylesterů. K oběma analýzám se používá konvenční kolona od výrobce J&W Scientific s fází typu DB-WAX o tloušťce filmu 0,25 μm, délce 30 m a vnitřním průměru 0,32 mm. Také teplotní program a další parametry plynově chromatografického stanovení jsou pro oba typy analýzy stejné. Stanovení vyšších alkoholů probíhá rovněž na stejné koloně, ale za jiných podmínek. Jako „narrow bore“ kolona byla použita kolona J&W Scientific se stejnou fází DB-WAX o tloušťce filmu0,18μm, délce 10 m a vnitřním průměru 0,18 mm. Pracovní podmínky pro tenkou kolonu byly vypočítány pomocí překladového software volně přístupného na internetových stránkách firmy Agilent Technologies. Podmínky měření pro oba typy kolon jsou pro stanovení mastných kyselin uvedeny v tab. 1. Tab. 2 uvádí podmínky měření pro stanovení vyšších alkoholů v pivu.

Tab. 1 Pracovní chromatografické podmínky pro stanovení nižších volných mastných kyselin a vyšších mastných kyselin ve formě methylesterů v pivu pro konvenční a velmi tenkou kapilární kolonu

Tab. 2 Pracovní chromatografické podmínky pro stanovení vyšších alkoholů v pivu pro konvenční a velmi tenkou kapilární kolonu

Na obr. 1 je porovnání chromatogramů analýzy nižších mastných kyselin v reálném vzorku piva na obou kolonách. Obr. 2 ukazuje chromatografické záznamy získané z obou typů kolon při analýze vyšších mastných kyselin jako jejich methylesterů v pivu. Obr. 3 porovnává chromatogramy naměřené na výše uvedených typech kolon při stanovení obsahu vyšších a aromatických alkoholů v pivu. Uvedené obrázky dokládají očekávanou skutečnost, že chromatografické rozlišení je na obou kolonách velmi podobné. Z uvedených chromatogramů je také jasně patrné výrazné zkrácení doby analýzy.

Obr. 1 Stanovení volných nižších mastných kyselin v pivu A) na koloně J&W Scietific DB WAX, 30 m, 0,32 mm vnitřního průměru a 0,25μm tloušťce filmu a B) na koloně J&W Scietific DB WAX, 10 m, 0,18 mm vnitřního průměru a 0,18 μm tloušťce filmu. 1 – isomáselná kyselina, 2 – máselná kyselina, 3 – isovalerová kyselina, 4 – valerová kyselina, 5 – kapronová kyselina, 6 – heptanová kyselina (vnitřní standard), 7 – kaprylová kyselina, 8 – pelargonová kyselina, 9 – kaprinová kyselina

Obr. 2 Stanovení vyšších mastných kyselin jako methylesterů v pivu A) na koloně J&W Scietific DB WAX, 30 m, 0,32 mm vnitřního průměrua 0,25 μm tloušťce filmu a B) na koloně J&W Scietific DB WAX, 10 m, 0,18 mm vnitřního průměru a 0,18 μm tloušťce filmu. 1 – laurová kyselina, 2 – tridekanová kyselina (vnitřní standard), 3 – myristová kyselina, 4 –pentadekanová kyselina (interní standard), 5 – palmitová kyselina, 6 – heptadekanová kyselina (vnitřní standard), 7 – stearová kyselina, 8 – olejová kyselina, 9 – linolová kyselina, 10 –linoleová kyselina

Obr. 3 Stanovení vyšších alkoholů v pivu A) na koloně J&W Scietific DB WAX, 30 m, 0,32 mm vnitřního průměru a 0,25 μm tloušťce filmua B) na koloně J&W Scietific DB WAX, 10 m, 0,18 mm vnitřního průměru a 0,18 μm tloušťce filmu. 1 – ethylhexanol, 2 – furfurylakohol, 3– ß-fenylethanol, 4 – 4-ethylfenol (vnitřní standard)

Z retenčních časů posledního píku na chromatogramu lze určit faktor, který vyjadřuje časový zisk při použití tenké kapilární kolony. Srovnání skutečného časového zisku určeného z retenčních časů posledních píků a teoreticky vypočítaného pomocí překladového software pro stanovení nižších mastných kyselin, vyšších mastných kyselin a vyšších alkoholů je uvedeno v tab. 3.Rozdíly mezi skutečnou a teoretickou hodnotou lze vysvětlit tím, že při matematickém výpočtu se neuvažuje skutečná délka kolony, která se od deklarované může lišit. Konvenční kolona o vnitřním průměru 0,32 mm byla již mnohokrát zkracována. Pokud bychom počítali s opravdovou délkou použitých kolon, shoda by byla lepší.

Tab. 3 Porovnání skutečných a teoretických časových zisků vyjadřujících zrychlení analýzy při stanovení nižších a vyšších mastných kyselin a vyšších alkoholů v pivu

Při chromatografické analýze je velmi důležité z hlediska kvalitativního rozboru, aby byly dobře reprodukovatelné retenční časy jednotlivých látek. Pro kvantitativní analýzu je podstatné, aby zůstával konstantní poměr jednotlivých látek při opakované analýze téhož vzorku. Za tímto účelem bylo provedeno sedmkrát opakované měření stejného vzorku na obou kolonách pro stanovení nižších a vyšších mastných kyselin a vyšších alkoholů. V tab. 4 jsou uvedeny retenční časy a relativní plochy (vzhledem k celkové ploše integrovaných píků) chromatografických píků. Jak je vidět z této tabulky, reprodukovatelnost, vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka (RSD %), retenčních časů je lepší než 0,2 % pro konvenční kolonu a lepší než 0,25 % v případě tenké kolony pro obě metody stanovení. Relativní směrodatná odchylka pro plochu stanovovaných látek vykazuje hodnoty lepší než 5 % pro konvenční kolonu a lepší než 7 % pro tenkou kolonu. Rozdíly jsou tedy statisticky nevýznamné.

Tab. 4 Srovnání retenčních časů (tr) a relativních ploch sledovaných látek v pivu na obou typech kapilárních kolon

4 ZÁVĚR

Předložená práce ukázala, že kapilární kolony pro plynovou chromatografii s novým rozměrem vnitřního průměru 0,18 mm je možné s úspěchem využít i v dalších pivovarských rozborech jako je stanovení nižších a vyšších mastných kyselin stejně jako vyšších alkoholů v pivu. Tento typ kolon poskytuje srovnatelné pracovní charakteristiky jako klasické kapilární kolony s vnitřním průměrem 0,32 mm a přitom vlastní čas analýzy zkracuje o 52 % v případě stanovení nižších mastných kyselin, o 50 % v případě vyšších mastných kyselin a o 60 % při určení obsahu vyšších alkoholů v pivu. Výsledná časová úspora je sice menší vzhledem k době nutné ke zchlazení chromatografické pece na původní teplotu – tato doba se změnou kolony nikterak nemění – i tak ale jde o významné zrychlení analýzy. V důsledku toho se zvyšuje kapacita laboratoře a navíc je možné využít stávajících plynových chromatografů na rozdíl od nasazení velmi tenkých kapilárních kolon s vnitřním průměrem 0,10 mm, které vyžadují speciální instrumentaci.