Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva

Plynová chromatografie má významnou úlohu při stanovování senzoricky aktivních látek, jejichž obsah je důležitý nejen pro sledování kvality již finálního výrobku, ale též při testování nových technologických postupů. Před vlastním plynově chromatografickým stanovením je však nutné stanovované látky vyextrahovat, zkoncentrovat a eventuálně přečistit. Za tímto účelem bylo během posledních dvaceti let představeno mnoho technik pro přípravu vzorků, které mohou nahradit dosud používané klasické postupy. Tyto postupy zahrnují off-line a on-line metody a jsou založeny jak na důkladné extrakci látek, tak na principech ustanovení rovnováhy. Tento přehled diskutuje výhody a nevýhody sedmi moderních postupů pro přípravu vzorků (headspace, purge and trap, extrakce na pevné fázi, mikroextrakce na pevné fázi, mikroextrakce na jedné kapce, superkritická fluidní extrakce, extrakce pomocí ultrazvuku), které je možné použít při analýze nápojů, a zejména piva.

1 ÚVOD

Příprava vzorků před vlastním stanovením sledovaných analytů je nutná především z následujících důvodů: zlepšení chromatografických vlastností analytů; zlepšení detekce látek; izolace sledovaných sloučenin z matrice.

Vzhledem k pokroku ve vývoji nových fází a celkové kvalitě dnešních kapilárních kolon první důvod není v současné době tím nejdůležitějším hlediskem. Zbývající dva aspekty (zlepšení detekce a účinnější odstranění interferujících látek) jsou však stále stejně důležité jako před několika desítkami let. Během let se také mnohokrát potvrdilo, že v průběhu celého analytického procesu je příprava vzorků většinou krokem, který je časově nejnáročnější, nejpracnější a také je nejnáchylnější ke vzniku chyb.

Během let se mnoho vědeckých týmů snažilo zavést nové postupy pro přípravu vzorků, které by nahradily tradiční soxhletovou extrakci nebo extrakci v systému kapalina-kapalina. Tyto moderní techniky pro přípravu vzorků tak zahrnují postupy od vysoce selektivních metod pro stanovení jedné nebo několika konkrétních látek, až po nepříliš selektivní postupy vhodné pro potřeby screeningu. Pozornost je zaměřena zejména na miniaturizaci a zkrácení doby nutné pro přípravu vzorku, a tím urychlení celého analytického procesu. Hlavními cíli při vývoji těchto postupů bylo, a stále zůstává, zvýšit kapacitu laboratoře pro dané stanovení, celkově zlepšit kvalitu přípravy vzorků, dosáhnout lepších mezí detekce, snížit množství vzorku nutného k provedení analýzy, minimalizovat použití organických rozpouštědel a sorbentů a v konečném výsledku tak snížit i množství odpadu (1).

Tato přehledová studie je zaměřena na představení moderních technik pro přípravu vzorků, které se dají využít při analýze nápojů zejména piva. Každá technika je krátce popsána, jsou diskutovány její výhody a nevýhody a uvedeny vybrané aplikace. Pracovní a validační charakteristiky postupů nejsou v této studii porovnávány.

2 METODY PŘÍPRAVY VZORKŮ

2.1 Headspace a Purge-and-Trap

Headspace technika je základní a velmi často používaná technika pro stanovení těkavých látek. K analýze na plynovém chromatografu se dávkuje plynná fáze, která je v rovnovážném stavu s kapalnou fází vzorku. Často se vhodným způsobem zajistí obohacení plynné fáze sledovanými analyty, čímž se zlepší citlivost. Díky tomu, že se nastřikuje pouze plynná fáze, se tak výrazným způsobem potlačuje zatížení chromatografického systému nežádoucími interferujícími nebo znečišťujícími látkami, což výrazným způsobem prodlužuje životnost kapilární kolony. Metoda byla poprvé popsána v roce 1958 (2), a brzy poté firma Perkin Elmer uvedla na trh plně automatický headspace dávkovač spojený s plynovým chromatografem.

U headspace postupu je hlavní proměnnou distribuční konstanta analytu mezi plynnou fází a kapalnou fází. Čím více je rovnováha posunuta k plynné fázi, tím s větší citlivostí bude látka stanovena. Současný stav headspace techniky popisuje celá řada publikací, např. (3–8).

Headspace analýza může být prováděna dvěma způsoby. Pokud je vzorek v rovnovážném stavu s plynnou fází v uzavřeném prostoru (vialce), potom se tato metoda nazývá statický headspace, zkráceně HS. Pokud nosný plyn proudí nad hladinou vzorku nebo probublává vzorkem a extrahované těkavé látky se zachytávají v kryogenní nebo sorpční pasti, pak se tento postup označuje jako dynamický headspace, gas-phase stripping nebo purge-and-trap, zkráceně společné označení P&T.

HS analýzy

Při HS analýze se ustavuje rovnováha mezi těkavými látkami obsaženými ve vzorku a v parní fázi nad vzorkem v plynotěsně uzavřené vialce. Po určité době nutné k ustanovení rovnováhy je část plynné fáze odebrána z vialky a nastříknuta na kolonu plynového chromatografu. K podpoře vytěsnění látek z kapalného vzorku do parního prostoru (pro látky s nízkou distribuční konstantou, které z větší části zůstávají v kapalné fázi) je možno použít zvýšenou teplotu ekvilibrace nebo zvýšit iontovou sílu vzorku pomocí vysolení. Účinné je také míchání nebo třepání vzorku během ustavování rovnováhy.

Po ustanovení rovnováhy je plynná fáze nastříknuta na kolonu buď pomocí plynotěsné stříkačky, nebo je jí nejprve naplněna vyhřívaná dávkovací smyčka a po přepnutí dávkovacího ventilu je obsah smyčky nosným plynem vypláchnut na kolonu (5–9).

Stejná doba ustavování rovnováhy a přesná kontrola teploty během inkubace jak vzorků tak i standardů představují kritické kroky pro zajištění přesné kvantifikace a odpovídající opakovatelnosti/reprodukovatelnosti. Tyto požadavky bezezbytku splňují automatické HS dávkovače. S jejich využitím je celý postup přípravy vzorků velmi jednoduchý (1).

P&T analýzy

Během P&T analýzy je vzorek kontinuálně proplachován inertním plynem, většinou heliem, a těkavé látky jsou vytěsňovány ze vzorku do trapu s dostatečně velkou retenční kapacitou (např. Tenax, aktivní uhlí nebo křemelina) tak, aby nedošlo k průniku sledovaných látek. Po vypuzení látek se trap rychle zahřeje a zachycené analyty jsou uvolněny na chromatografickou kolonu často ještě s předřazenou studenou pastí z důvodu zaostření zón. Vzhledem k tomuto zakoncentrování látek dosahuje technika P&T podstatně lepších mezí detekce v porovnání s HS postupem založeným pouze na rovnovážném stavu kapalina-plyn.

K hlavním faktorům ovlivňujícím P&T analýzu patří optimalizace doby proplachování vzorku, průtok proplachovacího plynu a teplota. Prodloužení doby proplachování obecně zvyšuje výtěžnost. Na druhé straně, pokud proplachovací doba je příliš dlouhá a trap nemá dostatečnou retenční kapacitu, může pro vysoce těkavé látky dojít k průniku látek, a tak k znemožnění přesné kvantifikace. Co se týče teploty, zejména při stanovování obsahu méně těkavých látek, které se ze vzorku vypudí jen částečně, je pro přesnou kvantifikaci nezbytně nutná její důsledná kontrola během celé P&T analýzy. Ze zřejmých důvodů zvýšení teploty vede ke zlepšení výtěžnosti. Avšak v důsledku toho se do trapu dostává hodně vodní páry. Toto je hlavní nevýhoda P&T techniky ve srovnání s HS metodou, kde objemy plynné fáze dávkované na kolonu jsou relativně malé. Vzhledem k tomu, že se pro zachytávání látek používá studený záchyt, může poměrně snadno dojít k jejich zablokování právě v důsledku velkého objemu vodní páry. Proto je důležité před vstupem do pasti vlhkost z proplachovacího plynu odstranit. Za tímto účelem se používají různá anorganická sušidla, kondenzátory nebo i selektivní permeační polymerové membrány (např. Nafion). Jejich použití však někdy může mít za následek nekontrolovatelnou ztrátu některých analytů (1, 10).

Aplikace

V průběhu let bylo publikováno ohromné množství prací využívajících tyto techniky v potravinářském průmyslu. Některé, zaměřené zejména na oblast pivovarské analytiky, jsou uvedeny v tab. 1. Využití HS postupu je součástí řady oficiálních metodik EBC, IOB, MEBAK. Použití P&T techniky při analýze piva velmi komplikuje pěnivost matrice (24).

Tab. 1 Vybrané aplikace použití HS technik

2.2 Extrakce na pevné fázi

Extrakce na pevné fázi (SPE) jako metoda pro přípravu vodných vzorků byla představena v sedmdesátých letech. Metoda se využívá především k zakoncentrování a někdy také k přečištění stanovovaných analytů.

Díky jednoduchosti a snadnému použití SPE vyústil zájem o tuto techniku ke komerčnímu používání jednorázových minikolonek. Tyto kolonky jsou plněny různými sorbenty o různé velikosti částic. K přetlačení vzorku a promývacího roztoku skrze kolonku je díky velikosti částic možné použít nízkého tlaku. Jako sorbenty se nejčastěji používají modifikovaný i nemodifikovaný oxid křemičitý, oxid hlinitý, polymery atd. Pro obrácenou fázi jsou k dispozici oktadecyl (C18), oktyl (C8), ethyl (C2), cyklohexyl, fenyl, butyl (C4). Pro normální fázi se používá oxid křemičitý modifikovaný skupinami kyano (-CN), amino (-NH2), dioly (-COHCOH). Pro adsorpci se využívá silikagel (-SiOH), florisil (Mg2SiO3), oxid hlinitý (Al2O3). K iontové výměně se využívá skupin amino (-NH2), kvarterního aminu (N+), karboxylové skupiny (-COOH), aromatické sulfonové kyseliny (ArSO2OH) nebo polyethyleniminu [-(CH2CH2NH)n-].

Velmi důležitým kritériem umožňujícím vysokou opakovatelnost analytických výsledků je zajištění konstantní kvality různých šarží jednorázových SPE kolonek. K tomuto účelu se jako charakteristika SPE kolonky používá kapacita kolonky. Kapacita se vyjadřuje jako poměr mg analytu/g sorbentu a znamená, že za stejných podmínek různé šarže kolonek adsorbují a desorbují stejné množství analytu. Stejnoměrnou kvalitu šarží dnes většinou firmy garantují certifikovaným procesem výroby SPE kolonek.

Před analýzou je nutné SPE kolonku nejprve kondicionovat. Poté se kolonkou prosaje vzorek, obvykle okolo 10 ml, rychlostí několika ml/min. Pak se kolonka propláchne několika mililitry vody, vysuší se jemným proudem dusíku za laboratorní teploty. Nakonec jsou zachycené analyty desorbovány malým množstvím (okolo 100 μl) organického rozpouštědla a analyzovány na plynovém chromatografu nebo po převedení do vhodného rozpouštědla, většinou mobilní fáze, nastříknuty na kolonu kapalinového chromatografu (1). Celý proces SPE lze automatizovat a přímo propojit s dávkovačem vzorků na plynovém nebo kapalinovém chromatografu.

Aplikace

Typické využití SPE spočívá v analýze vody na stanovení pesticidů a jiných kontaminantů životního prostředí. S úspěchem lze však tento postup využít i v pivovarské analytice, jak vyplývá z tab. 2.

Tab. 2 Vybrané aplikace použití SPE metody

2.3 Mikroextrakce na pevné fázi

Mikroextrakce na pevné fázi – SPME – je adsorpčně/desorpční technika vyvinutá prof.Pawliszynem na University of Waterloo v první polovině 90. let a patentovaná firmou Supelco (45).

Nejdůležitější součástí je 1 cm nebo 2 cm dlouhé křemenné vlákno pokryté polymerem. Je spojeno s ocelovým pístem a umístěno v duté ocelové jehle, které chrání vlákno před mechanickým poškozením. Vlákno je zataženo dovnitř jehly, která propíchne septum v zátce vialky. Posunutím pístu se vlákno vysune do vzorku eventuálně do prostoru nad jeho hladinou (většinou se k extrakci používá 2–5 ml vzorku). Analyt se sorbuje do vrstvy pokrývající vlákno. Po dosažení sorpční rovnováhy (obvykle 2–30 min) se vlákno opět zasune dovnitř jehly a spolu s ní je vytaženo z vialky se vzorkem. Nakonec je jehla zavedena do injektoru plynového chromatografu, kde je analyt tepelně desorbován a nesen na GC kolonu.

Rovnovážný stav SPME je závislý na koncentraci analytu ve vzorku a na typu a tloušťce polymeru, který pokrývá křemenné vlákno. Množství adsorbovaného analytu závisí na distribuční konstantě a na tloušťce vrstvy polymeru. Doba extrakce je dána časem potřebným pro extrakci dostatečné koncentrace analytu s nejvyšší distribuční konstantou. Distribuční konstanta obecně vzrůstá s rostoucí molekulovou hmotností a bodem varu analytu.

Selektivitu extrakčního postupu lze ovlivnit typem polymeru pokrývajícího vlákno. Obecně se dá říci, že těkavé látky vyžadují silnější vrstvu polymeru a slabší vrstva je zase účinnější pro sorpci a desorpci středně těkavých analytů. Extrakční proces lze ovlivnit také pomocí vysolovacího efektu a/nebo úpravou pH, mícháním vzorku nebo jeho zahříváním.

Přímé ponoření SPME vlákna do vzorku vede pochopitelně k podstatně vyšší účinnosti extrakce než expozice vlákna v headspace prostoru. Avšak ponoření vlákna do velmi komplexních matric, které navíc mohou obsahovat vysokou koncentraci soli použité k vysolení nebo extrémní pH, může vést k rychlému zničení vlákna. Proto se při analýze piva používá podstatně šetrnější extrakce v headspace prostoru.

Hlavní přednost tohoto postupu spočívá v tom, že není zapotřebí vůbec žádných rozpouštědel. Na druhé straně SPME vlákna jsou velmi křehká. Při manipulaci je třeba opatrného, zručného zacházení, jinak dojde snadno k jeho zničení (1,46).

SPME vlákna dodává na trh firma Supelco a celá řada firem dodává automatické dávkovače umožňující pracovat s SPME vlákny, což určitě přispělo k značnému rozšíření tohoto extrakčního postupu.

Aplikace

SPME metoda byla zpočátku využívaná pro stanoveni těkavých látek v životním prostředí (47, 48). Postupně však tento postup našel uplatněni i v biomedicíně a analýze potravin [49, 50]. Použiti při analýze piva dokládá tab. 3.

Tab. 3 Vybrané aplikace použití SPME metody

2.4 Extrakce na míchací tyčince

Ve výše popsané SPME technice se extrakce provádí poměrně malým množstvím fáze nanesené na vlákno, což v některých analýzách omezuje nebo i vylučuje využití této metody. Proto byla vyvinuta další mikroextrakční technika – sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) – popsaná Baltussenem a kol. (64). Na trh se tento postup dostal pod křídly německé firmy Gerstel pod komerčním označením Twister. Detailní popis principu a možnosti spolu s omezením využití tohoto extrakčního postupu bude popsáno v dalších částech této série článků.

2.5 Mikroextrakce na jedné kapce

V druhé polovině 90. let Liu a Dasgupta představili koncept mikroextrakce na jedné kapce – SDME [65]. Při tomto postupu se mikrostříkačka naplní extrakčním rozpouštědlem eventuálně s vnitřním standardem. Jehlou se propíchne septum vialky se vzorkem a jehla se ponoří do vzorku. Přímo ve vzorku se na špičce jehly vyloučí kapka extrakčního rozpouštědla obvykle o objemu 1 μl. Po extrakci se kapka nasaje zpět do jehly a zavede se do injektoru plynového chromatografu.

Extrakci podporuje míchání vzorku, nicméně pokud se pracuje v režimu kapky vytvořené přímo ve vzorku, velkým nebezpečím se stává nestabilita vytvořené kapičky. Dalšími parametry ovlivňujícími extrakci jsou velikost kapky, doba extrakce, volba rozpouštědla, vysolování.

Jinou možností je umístění kapky těsně nad hladinou vzorku – head space SDME. Tento postup je velmi podobný headspace-SPME pouze s tím rozdílem, že vlákno je nahrazeno mikrokapičkou. HS-SDME v porovnání s HS-SPME se vyznačuje podobnou opakovatelností a rychlostí extrakce a navíc přináší určité výhody. Jednak je výběr rozpouštědel mnohem širší než výběr komerčně dostupných SPME vláken. Zvolená rozpouštědla mohou mít bod varu vyšší nebo nižší než látky, které chceme extrahovat, a také rozsah polarity extrakčního rozpouštědla může být velmi široký. Dále cena použitého rozpouštědla je naprosto zanedbatelná vzhledem k ceně SPME vláken. Na druhé straně komplikace při HS-SDME způsobuje nebezpečí příliš rychlého odpaření kapky níže vroucího rozpouštědla v průběhu extrakce. Z tohoto důvodu se výběr vhodného rozpouštědla poněkud zužuje. Např. při analýze piva metodou HS-SDME se ze tří rozpouštědel (dekan, o-xylen a ethylenglykol) jako nejúčinnější prokázal ethyle nglykol (66).

Výhodou SDME postupu je minimální spotřeba rozpouštědel. Vzhledem k podobnosti metody SDME s SPME se dá tento postup lehce automatizovat a po malé úpravě se dají využít SPME autosamplery.

Aplikace

Metoda SDME byla využita především při analýze vzorků životního prostředí, biologických vzorků a potravin. Použití při analýze piva shrnuje tab. 4.

Tab. 4 Použití SDME při analýze piva

2.6 Superkritická extrakce

Superkritická extrakce kapalin (SFE) je založena na nízké vzájemné rozpustnosti vody a nadkritického CO2. V oblasti nadkritického tlaku a teploty se chová nadkritický CO2 jako organické rozpouštědlo. Fáze nadkritického CO2 a kapalná fáze se v tomto případě odlišují dostatečnou polaritou i hustotou. I když je CO2 nepolární sloučenina vhodná zejména k extrakci nepolárních a mírně polárních látek z vodných prostředí, lze přídavkem vhodného modifikátoru (např. ethanol) docílit i zlepšené extrakce látek s vyšší polaritou.

Z experimentálního hlediska jsou možné dva přístupy použití SFE.

První možností je statické uspořádání, kdy je vodný roztok umístěn do extrakční cely a nadkritický CO2, zavedený ke dnu nádobky, prochází díky nižší hustotě sloupcem vzorku. V tomto případě je limitujícím faktorem objem vzorku a kinetika reakce je velmi často řízena rychlostí difuze analytů ve vodné fázi. Plocha mezifázového rozhraní je obvykle nízká, což vede k dlouhým extrakčním časům. Druhou možností je využití dynamického způsobu extrakce. Při tomto způsobu se do určité míry neomezuje objem vzorku, a tím se výrazně zvyšuje citlivost metody. Systém tvoří dvě reciproční čerpadla, z nichž jedno dodává nadkritický CO2, druhé dávkuje vodný vzorek.

Výhodou SFE je odstranění nutnosti použít v procesu extrakce toxická organická rozpouštědla. Postup také umožňuje plnou automatizaci (69,70).

Aplikace

SFE byla používána především pro stanovení PAH a PCB. Využití lze najít i ve stanovení analytů významných pro pivovarství (tab. 5).

Tab. 5 Použití SFE při analýze piva

2.7 Extrakce za pomoci ultrazvuku

Při extrakci za pomoci ultrazvuku – USE – se k extrakci látek využívá akustických vibrací s frekvencí nad 20 kHz. Zvukové vlny jsou odlišné od elektromagnetických. Zatímco elektromagnetické se šíří vakuem, zvukové vlny se musí šířit skrze medium. V kapalině vlny produkují tlaky, jejichž výsledkem jsou bubliny nebo dutiny. Když bublina není schopná dále absorbovat energii z ultrazvuku, imploduje. Tento proces proběhne asi během 400 μs. Rychlá adiabatická komprese plynů v dutinách má za následek extrémně vysoké teploty a tlaky, které mohou dosahovat až 5000 °C a 100 MPa. Když se dutina dostane k pevnému povrchu, zkolabuje a vytvoří vysokorychlostní proud kapaliny. Kapalina proudí k povrchu rychlostí blížící se 400 km/h. Takový prudký dopad může vytvořit nové exploze a konečně vede ke vzniku vysoce reaktivních povrchů. Velmi vysoké teploty, které zvyšují rozpustnost a difuzivitu, a tlaky, které usnadňují prostupnost a transport látek, výrazným způsobem zvyšují účinnost extrakce.

Extrakce pomocí ultrazvuku se nejčastěji provádí v ultrazvukových lázních. Zde ale dochází k rozptylu ultrazvukové energie. Účinnější jsou proto ultrazvukové sondy, kde je veškerá energie ultrazvukových vln zaostřena na vzorek (1, 72).

Aplikace

Extrakce pomocí ultrazvuku se používá pro izolaci širokého spektra látek v nejrůznějších matricích. Některé příklady z oblasti analýzy nápojů přináší tab. 6.

Tab. 6. Použití USE při analýze nápojů

3 ZÁVĚR

Současný stav plynově chromatografické instrumentace zejména díky úžasným možnostem různých typů hmotnostních detektorů představuje mocný nástroj v analýze potravin. Umožňuje stanovit nejen konkrétní látky, ale také rychle fingerprinty, které mohou posloužit k potvrzení nebo vyvrácení tvrzení o původu potravin. Přesto příprava vzorků před vlastním chromatografickým měřením stále hraje klíčovou roli. Z uvedeného přehledu vyplývá, že oblast přípravy vzorků je stále otevřená novým postupům, optimalizacím a/nebo modifikacím. Stále je prostor pro zjednodušení postupů, zlepšení jejich účinnosti, zvýšení možného počtu zpracovaných vzorků, usnadnění identifikace a kvantifikace látek.

Vysvětlivky

• AED – atomově emisní detektor

• ATNC – zdánlivé celkové N-nitrososloučeniny
• DMS – dimethylsulfid
• ECD – detektor elektronového záchytu
• FID – plamenoionizační detektor
• FPD – plameno-fotometrický detektor
• MS – hmotnostní detektor
• PAH – polycyklické aromatické uhlovodíky
• PCB – polychlorované bifenyly
• VHOC – těkavé halogenované organické sloučeniny