Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 2. - Extrakce na míchací tyčince

Mezi moderními postupy pro přípravu vzorků zastává extrakce na míchací tyčince významné místo. Tato technika se používá hlavně pro extrakci těkavých a středně těkavých látek z kapalných vzorků. Práce diskutuje vliv důležitých parametrů nutných k optimalizaci SBSE extrakce (doba extrakce, pH vzorku, iontová síla, vliv organických činidel, teploty, míchání, derivatizace, desorpční podmínky). Pozornost je také věnována vývoji nových fází, které by umožnily další rozšíření použití SBSE techniky. Práce se také zabývá přehledem aplikací SBSE metody při analýze nápojů a zejména piva.

1 ÚVOD

Jak vyplynulo z předešlé části této série článků {1}, současné trendy v analytické chemii jednoznačně směřují ke zjednodušení a miniaturizaci přípravy vzorků. Dalším významným rysem je minimalizace spotřeby organických rozpouštědel a zpracovávaného objemu vzorku. V konečném důsledku to vede také ke snížení finančních nákladů na analýzu.

Mikroextrakce se dá definovat jako extrakce, kde objem fáze, do které se extrahuje, je velmi malý ve srovnání s objemem extrahovaného vzorku. Většinou extrakce není úplná, dochází k vyextrahování pouze podílu stanovovaných látek. Kolik látky rozpuštěné v roztoku se vyextrahuje do extrakční fáze, závisí od afinity látky k extrakční fázi, rozdělovacího koeficientu látky mezi vzorkem a extrakční fází a také od fyzikálně chemických vlastností látky {2, 3}.

Typickým příkladem takových postupů je mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a extrakce na míchací tyčince (SBSE). Jde o techniky, kde během jednoho kroku dochází k extrakci a zároveň zakoncentrování sledovaných analytů, čímž se zároveň redukuje i čas nutný pro přípravu vzorku.

Extrakce na míchací tyčince byla vyvinuta ve Výzkumném ústavu pro chromatografii (Kortrijk, Belgie) v roce 1999 týmem pod vedením prof. Sandry {4}. Technika byla uvedena na trh firmou Gerstel (Mülheim, Německo) pod komerčním názvem Twister. SBSE je postup umožňující extrakci a zakoncentrování látek z kapalných matric bez použití rozpouštědel {5, 6}.

2 PRINCIP A TEORIE EXTRAKCE NA MÍCHACÍ TYČINCE

Tato sorpčně extrakční metoda je založena na stejných principech jako SPME – na rozdělení mezi matricí vzorku a extrakční fází. Na rozdíl od SPME vlákna pokrytého polymerem, se SBSE skládá ze tří hlavních částí:

1. magnetické míchací tyčinky, která je nutná k přenosu rotačního momentu magnetického míchadla do kapalného vzorku,

2. tenkého skleněného pouzdra, ve kterém je umístěna magnetická míchací tyčinka a

3. vrstvy polydimethylsiloxanového (PDMS) sorbentu, do kterého se analyty extrahují.

Skleněný obal míchací tyčinky je důležitý k tomu, aby zabránil rozkladu PDMS vrstvy, která by jinak mohla být katalyzována kovy magnetické míchací tyčinky {7}. Míchací tyčinka je obvykle dlouhá 10–20 mm pokrytá 25–125 μl (0,3–1,0 mm tloušťka vrstvy) PDMS.

Analyty jsou rozděleny nebo absorbovány do PDMS fáze. Absorpce je podstatně slabší proces než adsorpce, takže látky mohou být desorbovány při nižších teplotách, což je příznivé pro stanovení termolabilních látek. Další důležitou skutečností je, že kapacita PDMS fáze pro danou látku není ovlivněna přítomností vysokého obsahu vody nebo i jiných látek, protože v PDMS fázi se každá sloučenina vyznačuje svým vlastním rovnovážným stavem a nedochází tak k nežádoucímu vytěsňování. Na druhé straně degradační části PDMS fáze obsahují typické křemíkové hmotnostní fragmenty, které se objeví v chromatogramu při použití hmotnostního detektoru {3,4}.

Extrakce látky z kapalné fáze do extrakční fáze se řídí rozdělovacím koeficientem látky mezi PDMS a kapalnou fází. Tento rozdělující koeficient velmi dobře koreluje s rozdělovacím koeficientem oktanolvoda (Ko/w). I když to není úplně přesné, tak hodnota rozdělovacího koeficientu oktanol-voda poskytuje velmi dobrou představu, jestli vůbec sloučenina bude a pokud ano, tak jak dobře, extrahována pomocí metody SBSE {3,5}.

Rozdělovací koeficient mezi PDMS a vodnou fází (Kpdms/w) je definován jako poměr mezi koncentrací analytu v PDMS fázi (Cpdms) a koncentrací ve vodě (Cw) v rovnovážném stavu. Tento poměr je roven poměru množství látky v PDMS (mpdms) k množství tohoto analytu ve vodné fázi (mw) násobeno fázovým poměrem (kde odpovídá Vw/Vpdms). {3,5}. (Viz rovnice (1))

Výtěžnost, vyjádřená jako poměr vyextrahovaného množství látky (mpdms) k množství látky v kapalné fázi (mo = mw + mpdms), je závislá na rozdělovacím koeficientu Kpdms/w a na ß, viz rovnice (2).

Z rovnice (2) vyplývá, že výtěžnost extrakce ovlivňují pouze dva faktory – Kpdms/w a ß. Čím vyšší je množství PDMS a čím nižší je ß, tím vyšší bude extrakční výtěžnost {3, 5}.

V SPME technice maximální objem PDMS nanesený na vlákno činí okolo 0,5 μl při tloušťce filmu 100 μm. Při typickém objemu vzorku 10 ml je fázový poměr 2 × 10⁴. Z toho vyplývá, že kvantitativní extrakce bude dosaženo pouze pro sloučeniny, jejichž Ko/w > 10⁵. Na druhé straně při SBSE metodě je na míchací tyčince naneseno 25–125 μl PDMS, a tudíž situace je mnohem příznivější. Míchací tyčinka pokrytá 100 μl PDMS fáze může být použita k extrakci 10 ml vodného vzorku a povede to k hodnotě koeficientu s hodnotou 100. To naznačuje, že látky s Ko/w větší než 500 budou kvantitativně extrahovány do PDMS fáze nanesené na míchací tyčinku. Pro analyty s Ko/w < 10⁵ tím dochází nejen k lepší kvantifikaci, ale především se velmi zlepšuje citlivost, a to 50 až 250krát {3,4,8}.

3 EXTRAKČNÍ POSTUP

Praktické provedení sorpční extrakce na míchací tyčince spočívá v umístění vzorku do headspace vialky nebo do jiné vhodné uzavíratelné nádoby. Do vzorku se vloží míchací tyčinka a vzorkem se míchá do ustanovení rovnováhy, obvykle mezi 30 až 240 min. Doba extrakce závisí na takových parametrech, jako jsou objem vzorku, rychlost míchání, teplota a velikost míchací tyčinky. Všechny tyto parametry se musí při konkrétní aplikaci optimalizovat. Po skončení extrakce se pomocí pinzety míchací tyčinka vyndá a opláchne se destilovanou vodou, aby se odstranily cukry, proteiny nebo jiné zbytky extrahované matrice. Dále se tyčinka usuší pomocí buničité vaty. Při oplachování míchací tyčinky podle práce autorů David a kol. nedochází ke ztrátě vyextrahovaných látek, protože absorbované analyty jsou přítomny uvnitř PDMS fáze {9}.

Další možností využití techniky SBSE je vzorkování z headspace prostoru. V tomto případě se míchací tyčinka umístí pomocí speciálního držáku do headspace prostoru nad kapalinou nebo pevným vzorkem {9}.

SBSE extrakci kyselých nebo zásaditých látek lze ovlivnit úpravou pH. Vzhledem k povaze PDMS vrstvy mohou být z matrice vyextrahovány pouze nepolární, neionizované látky. Pokud se tedy vhodným způsobem upraví pH, slabé kyseliny a zásady mohou být převedeny do svých neutrálních forem, ve kterých mohou být extrahovány do PDMS fáze.

Pokud se zvýší teplota, při které se provádí extrakce, poklesne hodnota rozdělovacího koeficientu látky rozpuštěné ve vzorku mezi PDMS fází a extrahovaným vzorkem. Na druhé straně díky snížení viskozity vzorku může dojít ke zvýšení difuze, což nakonec povede ke zkrácení ekvilibrační doby extrakce. Z toho plyne, že při optimalizaci SBSE metody je nutné zvolit vhodnou teplotu extrakce, při které bude dosaženo dostatečné citlivosti za přijatelnou dobu extrakce {9}.

K účinné extrakci velmi hydrofobních látek jako jsou např. polycyklické aromatické uhlovodíky nebo polychlorované bifenyly se do vzorku přidává okolo 10 % obj. organiky, aby se minimalizovala adsorpce na stěnách {10}.

Zvýšení výtěžností polárních látek s nízkou hodnotou Ko/w je možné dosáhnout pomocí derivatizace. Derivatizační reakce, které je možné použít ve vodných matricích, zahrnují acylaci fenolů pomocí anhydridu kyseliny octové, esterifikaci kyselin, acylaci aminů pomocí chlormravenčanu ethylnatého a oximaci aldehydů a ketonů pomocí o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamin hydrochloridu {7,11–14}.

4 DESORPCE ANALYTŮ

Desorpce vyextrahovaných analytů z PDMS fáze může být provedena buď pomocí termální desorpce, nebo zpětnou extrakcí pomocí malého objemu vhodného rozpouštědla. Při plynově chromatografickém stanovení je výhodnější použít termální desorpci. Desorpci rozpouštědlem lze použít nejen v kombinaci s plynovou chromatografií, ale také i s kapalinovou chromatografií. V tomto případě se míchací tyčinka vloží do malé vialky, většinou do insertu vialky, a přidá se obvykle okolo 100–200 μl organického rozpouštědla vhodného pro plynově chromatografické stanovení nebo mobilní fáze v případě kapalinové chromatografie {15,16}.

5 NOVÉ FÁZE – DALŠÍ VÝVOJ SBSE

Hlavní nevýhoda výše popsané sorpční extrakce spočívá v nepolární povaze PDMS fáze. Z tohoto důvodu SBSE metoda je rozšířena hlavně pro extrakci nepolárních nebo slabě polárních látek. Extrakce silně polárních látek (log Ko/w < 3) je obtížná. Lze je vyextrahovat jedině po jejich vhodné derivatizaci, což ale není vždy možné.

Z tohoto důvodu je snaha vyvinout Twister s dvěma nebo i více fázemi, a tak využít extrakční možnosti různých typů fází. Bicchi a kol. vyvinuli Twister s dvěma fázemi, kromě PDMS fáze použili různé na uhlíku vázané adsorbenty {17}. Podařilo se tak významným způsobem zlepšit výtěžnost těkavých polárních látek. Liu a kol. popsali použití kompaktní a termálně stabilní porézní fáze pro extrakci polycyklických aromatických uhlovodíků, n-alkanů a pesticidů z vody {18}.

Pro přímé vzorkování v biologických matricích připravil Lambert a kol. SBSE fázi využívající alkyl-diol-silikagel {19}. Jako nové polymerní fáze pro SBSE navrhli Neng a kol. polyuretanové pěny. Tyto pěny se vyznačují mimořádnou stabilitou a vynikající mechanickou odolností. Tyto pěny se mohou stát vhodnou alternativou k běžné PDMS fázi pro extrakci polárních analytů v stopových koncentracích. Také zlepšují extrakci triazinových herbicidů ve vodě {20-22}.

Jiná fáze obsahující kopolymer stearylesteru kyseliny methakrylové a ethylendimethakrylátu je vhodná pro současné stanovení šesti steroidních pohlavních hormonů v moči {23}. Jiný polymer poly(vinylpyridin-ethyl dimethakrylát) byl účinný pro cílenou extrakci fenolu a p-nitro fenolu {24}. Kopolymer vinylpyrrolidonu a divinylbenzenu účinně extrahoval polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy a fenoly. Tato fáze je schopná extrahovat i některé ionty těžkých kovů jako Cu²⁺, Pb²⁺, Cr³⁺ a Cd²⁺ {25}.

6 VYUŽITÍ SBSE PŘI ANALÝZE NÁPOJŮ

Široké použití našla technika SBSE při analýze nápojů. Např. stanovení kyseliny benzoové v nealkoholických nápojích je popsáno v práci Tredoux a kol., kde vzorek byl extrahován po dobu 40 min. Po vyextrahování byla tyčinka podrobena termální desorpci, analyty byly stanoveny GC metodou s hmotnostním detektorem {26}. Analýzou konzervačních látek ve vínu, octu, omáčkách a polevách se zabýval tým japonských výzkumníků {27}. Stanovením senzoricky aktivních látek ve vínu, saké, whisky, džusech, kávě se věnuje řada publikací {28-47}.

V pivovarské analytice byla metoda SBSE použita pro stanovení letinkové neboli světelné příchutě (3-methyl-2-buten-1-thiol) a dalších sirných látek {48}, karbonylových sloučenin {49} nebo chmelových terpenoidů {50}. V těchto případech byly analyty z míchací tyčinky tepelně desorbovány a analyzovány pomocí plynové chromatografie. Stejným způsobem byly stanoveny furfural, furfurylethylether, furyl hydroxymethylketon, 2,4-dodekadienal, ß-damascenon a ethylester kyseliny nikotinové, jen jako koncovka byla použita GC-TOFMS instrumentace {51}. Namísto tepelné desorpce je možné také analyty uvolnit z polydimethylsiloxanové fáze míchací tyčinky pomocí zpětné extrakce do malého množství rozpouštědla. Tímto postupem se zabýval kolektiv výzkumníků z VÚPS, a. s., Praha. Takto byly stanoveny některé estery (octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý, kaprylan ethylnatý, octan fenylnatý, kaprinan ethylnatý, octan fenylethylnatý, lauran ethylnatý, myristan ethylnatý a palmitan ethylnatý) {52, 53}, nižší mastné kyseliny {54, 55} nebo vicinální diketony {56}. Analyty byly separovány pomocí kapilární plynové chromatografie a detekovány plamenoionizačním detektorem (estery, mastné kyseliny), respektive detektorem elektronového záchytu (vicinální diketony). SBSE po reextrakci rozpouštědlem se dá využít i ve spojení s vysokotlakou kapalinovou chromatografií, jak dokládá práce popisující stanovení hořkých kyselin v pivu {57}.

7 ZÁVĚR

Předložený článek obsahuje přehled některých hledisek extrakce na míchací tyčince včetně základní teorie, podmínek, které je nutno optimalizovat, aplikací a omezení tohoto postupu. Bezesporu hlavní výhodou SBSE je kromě jednoduchosti podstatně větší množství fáze použité k extrakci, čímž výrazně stoupá extrakční účinnost ve srovnání s SPME postupem, který je založen na stejném principu. Hlavní nevýhoda spočívá v komerční dostupnosti pouze jediné fáze – nepolární PDMS. Z tohoto důvodu je možné techniku použít pouze pro extrakci nepolárních nebo slabě polárních látek. Proto další rozšíření této mikrotechniky spočívá v úspěšném použití nových fází schopných dobře extrahovat i polární látky.