Přihlášení
Registrace
Nastavení
Filtrování
Filtrování
Obnova hesla
Obnova hesla
Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu
St, 25.3.2020
| Originální článek z: Kvasný průmysl
Tato práce se zabývá využitím technik mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) pro stanovení mastných kyselin v pivu.

Pixabay/Bruno Marques Bru: Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu.

Mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) patří mezi moderní a jednoduché postupy přípravy vzorků. Tato práce se zabývá využitím těchto technik pro stanovení mastných kyselin v pivu. Zatímco z SPME vlákna byly analyty uvolněny termální desorpcí ve vyhřátém injektoru plynového chromatografu vybaveného křemennou kapilární kolonou ZB-WAX a plamenoionizačním detektorem, tak z míchací tyčinky byly vyextrahované látky uvolněny po zpětné extrakci do malého množství rozpouštědla a pak stanoveny na plynovém chromatografu. Kromě pracovních charakteristik obou postupů jsou uvedeny výhody a omezení těchto metod.

1 ÚVOD

Mastné kyseliny jsou jednou ze skupin látek, které mohou ovlivnit senzorické vlastnosti piva. Kromě toho mohou mít vliv na vitalitu kvasinek a také na stabilitu pivní pěny (1-3).

Nasycené mastné kyseliny (hexanová – dekanová kyselina) vznikají během kvašení (4). Tyto kyseliny se vyznačují žluklým nebo kozím aroma. Senzorické příspěvky těchto kyselin jsou kumulativní. Proto se tedy tyto cizí příchutě mohou projevit i tehdy, když koncentrace žádné z těchto kyselin nepřesahuje prahovou hodnotu vnímání (5). Obsah vyšších mastných kyselin jako je kyselina linolová a linolenová je významný z toho hlediska, že jejich oxidativní degradací může dojít ke vzniku typické staré chuti (6).

Z těchto důvodů je nutné mít k dispozici vhodnou analytickou metodu umožňující rychlé stanovení mastných kyselin v pivu. Mastné kyseliny se obvykle stanovují metodou plynové chromatografie. Při přípravě vzorků je možné namísto dříve používaných postupů založených na destilaci s vodní párou (7,8) nebo modernějších postupů využívajících extrakci na pevné fázi (9,10) s výhodou použít moderní metody jako je mikroextrakce na pevné fázi nebo sorpční extrakce na míchací tyčince.

Princip a využití mikroextrakce na pevné fázi (SPME) v pivovarské analytice bylo popsáno v úvodním článku této série (11). Teorie a možnosti praktického uplatnění sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) jsou popsány v následující práci (12).

V této práci jsou na konkrétním příkladě stanovení volných mastných kyselin v pivu ukázány možnosti dvou mikroextrakčních technik – SPME v headspace uspořádání a SBSE s následnou zpětnou extrakcí do organického rozpouštědla. Jsou diskutovány výhody a nevýhody obou postupů a také porovnány pracovní charakteristiky výše zmíněných metod.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie, standardy

Ethanol, síran amonný – Lach – Ner, s. r. o., ČR; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a syntetický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.

Kyselina hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), cis-9-oktadekanová (olejová), cis-9,cis-12-oktadekadienová (linolová) a cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová (linoleová) a derivatizační činidlo BF3 v 10% methanolu byly nakoupeny od Sigma-Aldrich, USA.

Vzorky piva plzeňského typu, vyrobené a balené v České republice, byly zakoupeny v běžné maloobchodní síti.

2.2 Podmínky plynové chromatografie

Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném split/splitless injektorem a plamenoionizačním detektorem. K separaci byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-Wax firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při 75 °C.

2.3 Headspace SPME

K extrakci bylo použito SPME vlákno s fází typu Carbowax-Divinylbenzen o tloušťce vrstvy 65 μm. Vlákno bylo umístěno v manuálním držáku pro SPME vlákna a vše bylo zakoupeno od Supelco, USA.

Vzorky piva byly před analýzou vychlazeny na 4 °C. Všechny pokusy vedoucí k porovnání pracovních charakteristik byly prováděny na modelovém roztoku 5 % obj. ethanolu ve vodě. Před použitím bylo vlákno kondicionováno v injektoru plynového chromatografu při teplotě 250 °C po dobu 30 min. Extrakce byla založena na podmínkách popsaných Horákem a kol. (13).

Extrakce byla prováděna v headspace prostoru nad 4 ml vzorku obohaceného přídavkem kyseliny heptanové a undekanové, které byly využity jako vnitřní standardy (výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l), ve skleněné vialce o objemu 20 ml uzavřené septem krytým hliníkovou fólií. K podpoře extrakce bylo využito vysolení pomocí 1,0 g síranu amonného. Před zahájením SPME extrakce byla vialka se vzorkem intenzivně třepána po dobu 10 s. Extrakce probíhala za laboratorní teploty po dobu 30 min.

Po extrakci bylo vlákno termálně desorbováno při teplotě 250 °C v nástřikovém prostoru plynového chromatografu po dobu 5 min. Injektor plynového chromatografu byl osazen linerem o vnitřním průměru 0,75 mm. Podmínky chromatografické separace jsou popsány v kap. 2.2.

2.3 Analýzy metodou SBSE

K extrakci byla použita míchací tyčinka o délce 10 mm a vnějším průměru 3,2 mm pokrytá polydimethylsiloxanovou (PDMS) vrstvou o tloušťce 0,5 mm. Tato míchací tyčinka pod komerčním názvem Twister byla zakoupena od Gerstel, Německo.

Twister byl před použitím kondicionován ve skleněné trubičce při teplotě 300 °C po dobu 60 min v atmosféře helia o průtoku 50 ml/min. Mastné kyseliny byly vyextrahovány vložením Twisteru do 10 ml vzorku obohaceného vnitřními standardy (kyseliny heptanová, undekanová, tridekanová a pentadekanová – výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l) v 20 ml skleněné vialce. Vialka byla uzavřena víčkem s PTFE/silikonovým septem. Extrakce probíhala za podmínek popsaných Horákem a kol. (14). Twisterem bylo mícháno rychlostí 1000 ot/min po dobu 60 min za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister pomocí pinzety vyndán ze vzorku, krátce opláchnut destilovanou vodou a osušen buničitou vatou. Pro zpětnou extrakci do rozpouštědla byl poté Twister vložen do insertu o objemu 350 μl obsahujícím 200 μl rozpouštědla dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Insert byl vložen do vialky o objemu 2 ml a uzavřen PTFE/silikonovým septem a vložen na míchadlo při 1000 ot/min po dobu 40 min.

Ke stanovení nižších mastných kyselin (C6 – C12) byly 2 μl výše získaného extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu a separace proběhla za podmínek popsaných v kap. 2.2.

Ke stanovení vyšších mastných kyselin bylo nutné získaný SBSE extrakt odpařit pod jemným proudem dusíku a derivatizovat methylací pomocí 0,1 ml BF3 v 10% methanolu po dobu 20 min při teplotě 95 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 0,1 ml vody. Methylestery vyšších mastných kyselin byly extrahovány do 0,1 ml hexanu v ultrazvukové lázni po dobu 2 min (15). Podmínky chromatografické separace byly stejné jako při stanovení nižších mastných kyselin.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro všechny stanovované volné mastné kyseliny byla proměřena kalibrační křivka v rozsahu koncentrací běžných pro pivo plzeňského typu (0,0015 mg/l až 8 mg/l) v 5 % obj. roztoku ethanolu. Jak vyplývá z tab. 1, lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty nižších mastných kyselin při použití lineární regrese ležely pro metodu SPME v rozmezí 0,9951 až 0,9983, pro SBSE extrakci v rozmezí 0,9919 až 0,9995. Při aplikaci kvadratické křivky rozsah hodnot korelačních koeficientů byl od 0,9956 do 0,9993 pro SPME postup, respektive od 0,9931 do 0,9993 pro SBSE metodu.

Tab. 1 Korelační koeficienty pro stanovení volných mastných kyselin v pivu pomocí metody SPME a SBSE

Vzhledem k tomu, že při použití metody SPME dochází v injektoru plynového chromatografu k termální desorpci všech analytů vyextrahovaných na SPME vlákno, nelze tímto postupem v rámci jednoho extrakčního kroku stanovit jak nižší, tak vyšší mastné kyseliny. Ke stanovení vyšších mastných kyselin by bylo nutné SPME extrakci opakovat. Následná derivatizace vyšších mastných kyselin přímo na vlákně je sice možná, ale použití, respektive manipulace s diazomethanovým činidlem není úplně bezproblémové (16). Z tohoto důvodu byly vyšší mastné kyseliny stanoveny jen SBSE postupem. Korelační koeficienty pro tyto kyseliny leží v intervalu 0,9981–0,9998 v případě lineární regrese a v rozmezí 0,9994–0,9997 při použití kvadratické křivky.

Z výsledků je patrné, že obě metody se v daném koncentračním rozmezí vyznačují vysokou linearitou.

Správnost metod byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v pěti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Výtěžnost SPME metody se nacházela v rozmezí 95–110 %. U metody SBSE byla výtěžnost nižších mastných kyselin podstatně horší (57–89 %). Příčina této malé výtěžnosti spočívá pravděpodobně v tom, že jako extrakční fáze je použita nepolární polydimethylsiloxanová vrstva Twisteru, do níž se tyto polární (zejména kyselina kapronová) nižší mastné kyseliny extrahují obtížně. Extrakci látky z kapalné fáze do extrakční fáze je možné, i když ne úplně přesně, popsat pomocí rozdělovacího koeficientu oktanol-voda (Ko/w) (17,18). Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro stanovované látky jsou uvedeny v tab. 3. Podle práce Baltussen a kol. (19) budou Twisterem kvantitativně vyextrahovány látky s Ko/w větším než 500 (odpovídá log Ko/w > 2,70). Hodnota log Ko/w pro kyselinu kapronovou je pouze 1,88, což naznačuje, že tato látka se bude obtížně extrahovat. Experimentálně dosažená výtěžnost 57 % pro tuto kyselinu tento teoretický předpoklad potvrzuje. Výtěžnosti vyšších mastných kyselin, jejichž log Ko/w > 6,10, dosahovaly podle očekávání vysokých hodnot 94–110 %.

Tab. 2 Výtěžnost a opakovatelnost SPME a SBSE postupů při stanovení volných mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)

Tab. 3 Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro nižší a vyšší mastné kyseliny

Opakovatelnost metod byla zjištěna pětinásobným opakováním celého postupu během jednoho dne na jednom a témž vzorku piva. Z výsledků uvedených v tab. 2 je vidět, že pro kyseliny kapronovou a kaprylovou byla hodnota relativní směrodatné odchylky (RSD) zhruba dvakrát horší při použití metody SBSE než u SPME postupu. To je zřejmě způsobeno jejich horší výtěžností. Naproti tomu u dalších homologických kyselin (kaprinová a laurová) jsou hodnoty RSD u obou postupů srovnatelné. Výrazně vyšší hodnoty opakovatelnosti (14,8–16,3 %) pro vyšší mastné kyseliny (myristovou – linolenovou) lze vysvětlit tím, že k jejich stanovení jsou ještě zapotřebí další dva kroky – derivatizace a následná extrakce methylesterů do hexanu. Každý z těchto kroků přispívá svým dílem k výsledné hodnotě RSD. Nicméně i tyto hodnoty RSD jsou plně akceptovatelné.

4 ZÁVĚR

Z výše uvedených výsledků je vidět, že pro stanovení mastných kyselin v pivu lze použít oba moderní postupy přípravy vzorků – SPME a SBSE. Obě techniky se vyznačují jednoduchostí, výbornou opakovatelností a žádnou nebo minimální spotřebou rozpouštědel.

Pro stanovení nižších mastných kyselin je vhodnější metoda SPME s vláknem potaženým fází typu Carbowax-Divinylbenzen. Pro tyto látky dosahuje toto SPME vlákno lepší výtěžnosti a opakovatelnosti než nepolární fáze Twisteru. Další nezanedbatelnou výhodou SPME postupu je jeho výrazně nižší časová náročnost (35 min oproti 160 min při použití SBSE metody). Na druhé straně značná nevýhoda spočívá v nemožnosti současného stanovení vyšších mastných kyselin v rámci jednoho extrakčního kroku.

Výhoda sorpční extrakce na míchací tyčince se zakládá na tom, že míchací tyčinka je podstatně robustnější než křehké SPME vlákno. Zacházení s SBSE je rovněž jednoduché, ale proces extrakce a následné reextrakce zabere podstatně více času.

Ačkoli obě techniky představují zaměnitelné alternativy, v případě požadavku na stanovení pouze nižších mastných kyselin v pivu je metoda SPME výhodnější. Pokud je nutno stanovit obsah jak nižších, tak vyšších mastných kyselin, bez problémů je možno využít techniku SBSE.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

EPA 8270 Re-optimized for Widest Calibration Range on the 5977 Inert Plus GC/MSD

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Solution for Environment & Agriculture Analysis

Brožury a specifikace
| 2020 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, GC/HRMS, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Životní prostředí, Potraviny a zemědělství

Analysis of VOCs in automotive trim components using TD-GC-MS

Aplikace
| 2020 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Termální desorpce, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific, Markes
Zaměření
Životní prostředí, Materiálová analýza
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Stanovení mastných kyselin v pivu rychlou, rutinní metodou

Tato práce popisuje stanovení mastných kyselin založené na technice extrakce na pevné fázi (SPE), rychlejší plynové chromatografie s kolonou o ID 0,18 mm a detekci pomocí plamenoionizačního detektoru (FID).
Vědecký článek | Potraviny

Extrakce na míchací tyčince – nová možnost při analýze některých senzoricky a aktivních látek v pivu

Tato práce se zabývá využitím SBSE při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu. Použita byla tyčinka (10 x 1,3 mm) pokrytá polydimethylsiloxanem od firmy Gerstel, komerčně nazývaná Twister.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení mastných kyselin v pivu technikou SPME

Předkládaná práce popisuje rychlou a jednoduchou možnost selektivního stanovení volných mastných kyselin (C6-C12) v pivu nebo mladině použitím mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a plynové chromatografie.
Vědecký článek | Potraviny

Využití některých moderních extrakčních postupů pro kvantitativní stanovení vicinálních diketonů v pivu.

Práce se zabývá vývojem a optimalizací metody sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE), porovnání s parametry mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a analýzy na plynovém chromatografu vybaveném ECD detektorem.
Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu
St, 25.3.2020
| Originální článek z: Kvasný průmysl
Tato práce se zabývá využitím technik mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) pro stanovení mastných kyselin v pivu.

Pixabay/Bruno Marques Bru: Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu.

Mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) patří mezi moderní a jednoduché postupy přípravy vzorků. Tato práce se zabývá využitím těchto technik pro stanovení mastných kyselin v pivu. Zatímco z SPME vlákna byly analyty uvolněny termální desorpcí ve vyhřátém injektoru plynového chromatografu vybaveného křemennou kapilární kolonou ZB-WAX a plamenoionizačním detektorem, tak z míchací tyčinky byly vyextrahované látky uvolněny po zpětné extrakci do malého množství rozpouštědla a pak stanoveny na plynovém chromatografu. Kromě pracovních charakteristik obou postupů jsou uvedeny výhody a omezení těchto metod.

1 ÚVOD

Mastné kyseliny jsou jednou ze skupin látek, které mohou ovlivnit senzorické vlastnosti piva. Kromě toho mohou mít vliv na vitalitu kvasinek a také na stabilitu pivní pěny (1-3).

Nasycené mastné kyseliny (hexanová – dekanová kyselina) vznikají během kvašení (4). Tyto kyseliny se vyznačují žluklým nebo kozím aroma. Senzorické příspěvky těchto kyselin jsou kumulativní. Proto se tedy tyto cizí příchutě mohou projevit i tehdy, když koncentrace žádné z těchto kyselin nepřesahuje prahovou hodnotu vnímání (5). Obsah vyšších mastných kyselin jako je kyselina linolová a linolenová je významný z toho hlediska, že jejich oxidativní degradací může dojít ke vzniku typické staré chuti (6).

Z těchto důvodů je nutné mít k dispozici vhodnou analytickou metodu umožňující rychlé stanovení mastných kyselin v pivu. Mastné kyseliny se obvykle stanovují metodou plynové chromatografie. Při přípravě vzorků je možné namísto dříve používaných postupů založených na destilaci s vodní párou (7,8) nebo modernějších postupů využívajících extrakci na pevné fázi (9,10) s výhodou použít moderní metody jako je mikroextrakce na pevné fázi nebo sorpční extrakce na míchací tyčince.

Princip a využití mikroextrakce na pevné fázi (SPME) v pivovarské analytice bylo popsáno v úvodním článku této série (11). Teorie a možnosti praktického uplatnění sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) jsou popsány v následující práci (12).

V této práci jsou na konkrétním příkladě stanovení volných mastných kyselin v pivu ukázány možnosti dvou mikroextrakčních technik – SPME v headspace uspořádání a SBSE s následnou zpětnou extrakcí do organického rozpouštědla. Jsou diskutovány výhody a nevýhody obou postupů a také porovnány pracovní charakteristiky výše zmíněných metod.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie, standardy

Ethanol, síran amonný – Lach – Ner, s. r. o., ČR; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a syntetický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.

Kyselina hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), cis-9-oktadekanová (olejová), cis-9,cis-12-oktadekadienová (linolová) a cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová (linoleová) a derivatizační činidlo BF3 v 10% methanolu byly nakoupeny od Sigma-Aldrich, USA.

Vzorky piva plzeňského typu, vyrobené a balené v České republice, byly zakoupeny v běžné maloobchodní síti.

2.2 Podmínky plynové chromatografie

Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném split/splitless injektorem a plamenoionizačním detektorem. K separaci byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-Wax firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při 75 °C.

2.3 Headspace SPME

K extrakci bylo použito SPME vlákno s fází typu Carbowax-Divinylbenzen o tloušťce vrstvy 65 μm. Vlákno bylo umístěno v manuálním držáku pro SPME vlákna a vše bylo zakoupeno od Supelco, USA.

Vzorky piva byly před analýzou vychlazeny na 4 °C. Všechny pokusy vedoucí k porovnání pracovních charakteristik byly prováděny na modelovém roztoku 5 % obj. ethanolu ve vodě. Před použitím bylo vlákno kondicionováno v injektoru plynového chromatografu při teplotě 250 °C po dobu 30 min. Extrakce byla založena na podmínkách popsaných Horákem a kol. (13).

Extrakce byla prováděna v headspace prostoru nad 4 ml vzorku obohaceného přídavkem kyseliny heptanové a undekanové, které byly využity jako vnitřní standardy (výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l), ve skleněné vialce o objemu 20 ml uzavřené septem krytým hliníkovou fólií. K podpoře extrakce bylo využito vysolení pomocí 1,0 g síranu amonného. Před zahájením SPME extrakce byla vialka se vzorkem intenzivně třepána po dobu 10 s. Extrakce probíhala za laboratorní teploty po dobu 30 min.

Po extrakci bylo vlákno termálně desorbováno při teplotě 250 °C v nástřikovém prostoru plynového chromatografu po dobu 5 min. Injektor plynového chromatografu byl osazen linerem o vnitřním průměru 0,75 mm. Podmínky chromatografické separace jsou popsány v kap. 2.2.

2.3 Analýzy metodou SBSE

K extrakci byla použita míchací tyčinka o délce 10 mm a vnějším průměru 3,2 mm pokrytá polydimethylsiloxanovou (PDMS) vrstvou o tloušťce 0,5 mm. Tato míchací tyčinka pod komerčním názvem Twister byla zakoupena od Gerstel, Německo.

Twister byl před použitím kondicionován ve skleněné trubičce při teplotě 300 °C po dobu 60 min v atmosféře helia o průtoku 50 ml/min. Mastné kyseliny byly vyextrahovány vložením Twisteru do 10 ml vzorku obohaceného vnitřními standardy (kyseliny heptanová, undekanová, tridekanová a pentadekanová – výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l) v 20 ml skleněné vialce. Vialka byla uzavřena víčkem s PTFE/silikonovým septem. Extrakce probíhala za podmínek popsaných Horákem a kol. (14). Twisterem bylo mícháno rychlostí 1000 ot/min po dobu 60 min za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister pomocí pinzety vyndán ze vzorku, krátce opláchnut destilovanou vodou a osušen buničitou vatou. Pro zpětnou extrakci do rozpouštědla byl poté Twister vložen do insertu o objemu 350 μl obsahujícím 200 μl rozpouštědla dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Insert byl vložen do vialky o objemu 2 ml a uzavřen PTFE/silikonovým septem a vložen na míchadlo při 1000 ot/min po dobu 40 min.

Ke stanovení nižších mastných kyselin (C6 – C12) byly 2 μl výše získaného extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu a separace proběhla za podmínek popsaných v kap. 2.2.

Ke stanovení vyšších mastných kyselin bylo nutné získaný SBSE extrakt odpařit pod jemným proudem dusíku a derivatizovat methylací pomocí 0,1 ml BF3 v 10% methanolu po dobu 20 min při teplotě 95 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 0,1 ml vody. Methylestery vyšších mastných kyselin byly extrahovány do 0,1 ml hexanu v ultrazvukové lázni po dobu 2 min (15). Podmínky chromatografické separace byly stejné jako při stanovení nižších mastných kyselin.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro všechny stanovované volné mastné kyseliny byla proměřena kalibrační křivka v rozsahu koncentrací běžných pro pivo plzeňského typu (0,0015 mg/l až 8 mg/l) v 5 % obj. roztoku ethanolu. Jak vyplývá z tab. 1, lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty nižších mastných kyselin při použití lineární regrese ležely pro metodu SPME v rozmezí 0,9951 až 0,9983, pro SBSE extrakci v rozmezí 0,9919 až 0,9995. Při aplikaci kvadratické křivky rozsah hodnot korelačních koeficientů byl od 0,9956 do 0,9993 pro SPME postup, respektive od 0,9931 do 0,9993 pro SBSE metodu.

Tab. 1 Korelační koeficienty pro stanovení volných mastných kyselin v pivu pomocí metody SPME a SBSE

Vzhledem k tomu, že při použití metody SPME dochází v injektoru plynového chromatografu k termální desorpci všech analytů vyextrahovaných na SPME vlákno, nelze tímto postupem v rámci jednoho extrakčního kroku stanovit jak nižší, tak vyšší mastné kyseliny. Ke stanovení vyšších mastných kyselin by bylo nutné SPME extrakci opakovat. Následná derivatizace vyšších mastných kyselin přímo na vlákně je sice možná, ale použití, respektive manipulace s diazomethanovým činidlem není úplně bezproblémové (16). Z tohoto důvodu byly vyšší mastné kyseliny stanoveny jen SBSE postupem. Korelační koeficienty pro tyto kyseliny leží v intervalu 0,9981–0,9998 v případě lineární regrese a v rozmezí 0,9994–0,9997 při použití kvadratické křivky.

Z výsledků je patrné, že obě metody se v daném koncentračním rozmezí vyznačují vysokou linearitou.

Správnost metod byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v pěti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Výtěžnost SPME metody se nacházela v rozmezí 95–110 %. U metody SBSE byla výtěžnost nižších mastných kyselin podstatně horší (57–89 %). Příčina této malé výtěžnosti spočívá pravděpodobně v tom, že jako extrakční fáze je použita nepolární polydimethylsiloxanová vrstva Twisteru, do níž se tyto polární (zejména kyselina kapronová) nižší mastné kyseliny extrahují obtížně. Extrakci látky z kapalné fáze do extrakční fáze je možné, i když ne úplně přesně, popsat pomocí rozdělovacího koeficientu oktanol-voda (Ko/w) (17,18). Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro stanovované látky jsou uvedeny v tab. 3. Podle práce Baltussen a kol. (19) budou Twisterem kvantitativně vyextrahovány látky s Ko/w větším než 500 (odpovídá log Ko/w > 2,70). Hodnota log Ko/w pro kyselinu kapronovou je pouze 1,88, což naznačuje, že tato látka se bude obtížně extrahovat. Experimentálně dosažená výtěžnost 57 % pro tuto kyselinu tento teoretický předpoklad potvrzuje. Výtěžnosti vyšších mastných kyselin, jejichž log Ko/w > 6,10, dosahovaly podle očekávání vysokých hodnot 94–110 %.

Tab. 2 Výtěžnost a opakovatelnost SPME a SBSE postupů při stanovení volných mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)

Tab. 3 Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro nižší a vyšší mastné kyseliny

Opakovatelnost metod byla zjištěna pětinásobným opakováním celého postupu během jednoho dne na jednom a témž vzorku piva. Z výsledků uvedených v tab. 2 je vidět, že pro kyseliny kapronovou a kaprylovou byla hodnota relativní směrodatné odchylky (RSD) zhruba dvakrát horší při použití metody SBSE než u SPME postupu. To je zřejmě způsobeno jejich horší výtěžností. Naproti tomu u dalších homologických kyselin (kaprinová a laurová) jsou hodnoty RSD u obou postupů srovnatelné. Výrazně vyšší hodnoty opakovatelnosti (14,8–16,3 %) pro vyšší mastné kyseliny (myristovou – linolenovou) lze vysvětlit tím, že k jejich stanovení jsou ještě zapotřebí další dva kroky – derivatizace a následná extrakce methylesterů do hexanu. Každý z těchto kroků přispívá svým dílem k výsledné hodnotě RSD. Nicméně i tyto hodnoty RSD jsou plně akceptovatelné.

4 ZÁVĚR

Z výše uvedených výsledků je vidět, že pro stanovení mastných kyselin v pivu lze použít oba moderní postupy přípravy vzorků – SPME a SBSE. Obě techniky se vyznačují jednoduchostí, výbornou opakovatelností a žádnou nebo minimální spotřebou rozpouštědel.

Pro stanovení nižších mastných kyselin je vhodnější metoda SPME s vláknem potaženým fází typu Carbowax-Divinylbenzen. Pro tyto látky dosahuje toto SPME vlákno lepší výtěžnosti a opakovatelnosti než nepolární fáze Twisteru. Další nezanedbatelnou výhodou SPME postupu je jeho výrazně nižší časová náročnost (35 min oproti 160 min při použití SBSE metody). Na druhé straně značná nevýhoda spočívá v nemožnosti současného stanovení vyšších mastných kyselin v rámci jednoho extrakčního kroku.

Výhoda sorpční extrakce na míchací tyčince se zakládá na tom, že míchací tyčinka je podstatně robustnější než křehké SPME vlákno. Zacházení s SBSE je rovněž jednoduché, ale proces extrakce a následné reextrakce zabere podstatně více času.

Ačkoli obě techniky představují zaměnitelné alternativy, v případě požadavku na stanovení pouze nižších mastných kyselin v pivu je metoda SPME výhodnější. Pokud je nutno stanovit obsah jak nižších, tak vyšších mastných kyselin, bez problémů je možno využít techniku SBSE.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

EPA 8270 Re-optimized for Widest Calibration Range on the 5977 Inert Plus GC/MSD

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Solution for Environment & Agriculture Analysis

Brožury a specifikace
| 2020 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, GC/HRMS, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Životní prostředí, Potraviny a zemědělství

Analysis of VOCs in automotive trim components using TD-GC-MS

Aplikace
| 2020 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Termální desorpce, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific, Markes
Zaměření
Životní prostředí, Materiálová analýza
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Stanovení mastných kyselin v pivu rychlou, rutinní metodou

Tato práce popisuje stanovení mastných kyselin založené na technice extrakce na pevné fázi (SPE), rychlejší plynové chromatografie s kolonou o ID 0,18 mm a detekci pomocí plamenoionizačního detektoru (FID).
Vědecký článek | Potraviny

Extrakce na míchací tyčince – nová možnost při analýze některých senzoricky a aktivních látek v pivu

Tato práce se zabývá využitím SBSE při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu. Použita byla tyčinka (10 x 1,3 mm) pokrytá polydimethylsiloxanem od firmy Gerstel, komerčně nazývaná Twister.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení mastných kyselin v pivu technikou SPME

Předkládaná práce popisuje rychlou a jednoduchou možnost selektivního stanovení volných mastných kyselin (C6-C12) v pivu nebo mladině použitím mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a plynové chromatografie.
Vědecký článek | Potraviny

Využití některých moderních extrakčních postupů pro kvantitativní stanovení vicinálních diketonů v pivu.

Práce se zabývá vývojem a optimalizací metody sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE), porovnání s parametry mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a analýzy na plynovém chromatografu vybaveném ECD detektorem.
Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu
St, 25.3.2020
| Originální článek z: Kvasný průmysl
Tato práce se zabývá využitím technik mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) pro stanovení mastných kyselin v pivu.

Pixabay/Bruno Marques Bru: Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu.

Mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) patří mezi moderní a jednoduché postupy přípravy vzorků. Tato práce se zabývá využitím těchto technik pro stanovení mastných kyselin v pivu. Zatímco z SPME vlákna byly analyty uvolněny termální desorpcí ve vyhřátém injektoru plynového chromatografu vybaveného křemennou kapilární kolonou ZB-WAX a plamenoionizačním detektorem, tak z míchací tyčinky byly vyextrahované látky uvolněny po zpětné extrakci do malého množství rozpouštědla a pak stanoveny na plynovém chromatografu. Kromě pracovních charakteristik obou postupů jsou uvedeny výhody a omezení těchto metod.

1 ÚVOD

Mastné kyseliny jsou jednou ze skupin látek, které mohou ovlivnit senzorické vlastnosti piva. Kromě toho mohou mít vliv na vitalitu kvasinek a také na stabilitu pivní pěny (1-3).

Nasycené mastné kyseliny (hexanová – dekanová kyselina) vznikají během kvašení (4). Tyto kyseliny se vyznačují žluklým nebo kozím aroma. Senzorické příspěvky těchto kyselin jsou kumulativní. Proto se tedy tyto cizí příchutě mohou projevit i tehdy, když koncentrace žádné z těchto kyselin nepřesahuje prahovou hodnotu vnímání (5). Obsah vyšších mastných kyselin jako je kyselina linolová a linolenová je významný z toho hlediska, že jejich oxidativní degradací může dojít ke vzniku typické staré chuti (6).

Z těchto důvodů je nutné mít k dispozici vhodnou analytickou metodu umožňující rychlé stanovení mastných kyselin v pivu. Mastné kyseliny se obvykle stanovují metodou plynové chromatografie. Při přípravě vzorků je možné namísto dříve používaných postupů založených na destilaci s vodní párou (7,8) nebo modernějších postupů využívajících extrakci na pevné fázi (9,10) s výhodou použít moderní metody jako je mikroextrakce na pevné fázi nebo sorpční extrakce na míchací tyčince.

Princip a využití mikroextrakce na pevné fázi (SPME) v pivovarské analytice bylo popsáno v úvodním článku této série (11). Teorie a možnosti praktického uplatnění sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) jsou popsány v následující práci (12).

V této práci jsou na konkrétním příkladě stanovení volných mastných kyselin v pivu ukázány možnosti dvou mikroextrakčních technik – SPME v headspace uspořádání a SBSE s následnou zpětnou extrakcí do organického rozpouštědla. Jsou diskutovány výhody a nevýhody obou postupů a také porovnány pracovní charakteristiky výše zmíněných metod.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie, standardy

Ethanol, síran amonný – Lach – Ner, s. r. o., ČR; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a syntetický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.

Kyselina hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), cis-9-oktadekanová (olejová), cis-9,cis-12-oktadekadienová (linolová) a cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová (linoleová) a derivatizační činidlo BF3 v 10% methanolu byly nakoupeny od Sigma-Aldrich, USA.

Vzorky piva plzeňského typu, vyrobené a balené v České republice, byly zakoupeny v běžné maloobchodní síti.

2.2 Podmínky plynové chromatografie

Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném split/splitless injektorem a plamenoionizačním detektorem. K separaci byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-Wax firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při 75 °C.

2.3 Headspace SPME

K extrakci bylo použito SPME vlákno s fází typu Carbowax-Divinylbenzen o tloušťce vrstvy 65 μm. Vlákno bylo umístěno v manuálním držáku pro SPME vlákna a vše bylo zakoupeno od Supelco, USA.

Vzorky piva byly před analýzou vychlazeny na 4 °C. Všechny pokusy vedoucí k porovnání pracovních charakteristik byly prováděny na modelovém roztoku 5 % obj. ethanolu ve vodě. Před použitím bylo vlákno kondicionováno v injektoru plynového chromatografu při teplotě 250 °C po dobu 30 min. Extrakce byla založena na podmínkách popsaných Horákem a kol. (13).

Extrakce byla prováděna v headspace prostoru nad 4 ml vzorku obohaceného přídavkem kyseliny heptanové a undekanové, které byly využity jako vnitřní standardy (výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l), ve skleněné vialce o objemu 20 ml uzavřené septem krytým hliníkovou fólií. K podpoře extrakce bylo využito vysolení pomocí 1,0 g síranu amonného. Před zahájením SPME extrakce byla vialka se vzorkem intenzivně třepána po dobu 10 s. Extrakce probíhala za laboratorní teploty po dobu 30 min.

Po extrakci bylo vlákno termálně desorbováno při teplotě 250 °C v nástřikovém prostoru plynového chromatografu po dobu 5 min. Injektor plynového chromatografu byl osazen linerem o vnitřním průměru 0,75 mm. Podmínky chromatografické separace jsou popsány v kap. 2.2.

2.3 Analýzy metodou SBSE

K extrakci byla použita míchací tyčinka o délce 10 mm a vnějším průměru 3,2 mm pokrytá polydimethylsiloxanovou (PDMS) vrstvou o tloušťce 0,5 mm. Tato míchací tyčinka pod komerčním názvem Twister byla zakoupena od Gerstel, Německo.

Twister byl před použitím kondicionován ve skleněné trubičce při teplotě 300 °C po dobu 60 min v atmosféře helia o průtoku 50 ml/min. Mastné kyseliny byly vyextrahovány vložením Twisteru do 10 ml vzorku obohaceného vnitřními standardy (kyseliny heptanová, undekanová, tridekanová a pentadekanová – výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l) v 20 ml skleněné vialce. Vialka byla uzavřena víčkem s PTFE/silikonovým septem. Extrakce probíhala za podmínek popsaných Horákem a kol. (14). Twisterem bylo mícháno rychlostí 1000 ot/min po dobu 60 min za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister pomocí pinzety vyndán ze vzorku, krátce opláchnut destilovanou vodou a osušen buničitou vatou. Pro zpětnou extrakci do rozpouštědla byl poté Twister vložen do insertu o objemu 350 μl obsahujícím 200 μl rozpouštědla dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Insert byl vložen do vialky o objemu 2 ml a uzavřen PTFE/silikonovým septem a vložen na míchadlo při 1000 ot/min po dobu 40 min.

Ke stanovení nižších mastných kyselin (C6 – C12) byly 2 μl výše získaného extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu a separace proběhla za podmínek popsaných v kap. 2.2.

Ke stanovení vyšších mastných kyselin bylo nutné získaný SBSE extrakt odpařit pod jemným proudem dusíku a derivatizovat methylací pomocí 0,1 ml BF3 v 10% methanolu po dobu 20 min při teplotě 95 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 0,1 ml vody. Methylestery vyšších mastných kyselin byly extrahovány do 0,1 ml hexanu v ultrazvukové lázni po dobu 2 min (15). Podmínky chromatografické separace byly stejné jako při stanovení nižších mastných kyselin.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro všechny stanovované volné mastné kyseliny byla proměřena kalibrační křivka v rozsahu koncentrací běžných pro pivo plzeňského typu (0,0015 mg/l až 8 mg/l) v 5 % obj. roztoku ethanolu. Jak vyplývá z tab. 1, lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty nižších mastných kyselin při použití lineární regrese ležely pro metodu SPME v rozmezí 0,9951 až 0,9983, pro SBSE extrakci v rozmezí 0,9919 až 0,9995. Při aplikaci kvadratické křivky rozsah hodnot korelačních koeficientů byl od 0,9956 do 0,9993 pro SPME postup, respektive od 0,9931 do 0,9993 pro SBSE metodu.

Tab. 1 Korelační koeficienty pro stanovení volných mastných kyselin v pivu pomocí metody SPME a SBSE

Vzhledem k tomu, že při použití metody SPME dochází v injektoru plynového chromatografu k termální desorpci všech analytů vyextrahovaných na SPME vlákno, nelze tímto postupem v rámci jednoho extrakčního kroku stanovit jak nižší, tak vyšší mastné kyseliny. Ke stanovení vyšších mastných kyselin by bylo nutné SPME extrakci opakovat. Následná derivatizace vyšších mastných kyselin přímo na vlákně je sice možná, ale použití, respektive manipulace s diazomethanovým činidlem není úplně bezproblémové (16). Z tohoto důvodu byly vyšší mastné kyseliny stanoveny jen SBSE postupem. Korelační koeficienty pro tyto kyseliny leží v intervalu 0,9981–0,9998 v případě lineární regrese a v rozmezí 0,9994–0,9997 při použití kvadratické křivky.

Z výsledků je patrné, že obě metody se v daném koncentračním rozmezí vyznačují vysokou linearitou.

Správnost metod byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v pěti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Výtěžnost SPME metody se nacházela v rozmezí 95–110 %. U metody SBSE byla výtěžnost nižších mastných kyselin podstatně horší (57–89 %). Příčina této malé výtěžnosti spočívá pravděpodobně v tom, že jako extrakční fáze je použita nepolární polydimethylsiloxanová vrstva Twisteru, do níž se tyto polární (zejména kyselina kapronová) nižší mastné kyseliny extrahují obtížně. Extrakci látky z kapalné fáze do extrakční fáze je možné, i když ne úplně přesně, popsat pomocí rozdělovacího koeficientu oktanol-voda (Ko/w) (17,18). Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro stanovované látky jsou uvedeny v tab. 3. Podle práce Baltussen a kol. (19) budou Twisterem kvantitativně vyextrahovány látky s Ko/w větším než 500 (odpovídá log Ko/w > 2,70). Hodnota log Ko/w pro kyselinu kapronovou je pouze 1,88, což naznačuje, že tato látka se bude obtížně extrahovat. Experimentálně dosažená výtěžnost 57 % pro tuto kyselinu tento teoretický předpoklad potvrzuje. Výtěžnosti vyšších mastných kyselin, jejichž log Ko/w > 6,10, dosahovaly podle očekávání vysokých hodnot 94–110 %.

Tab. 2 Výtěžnost a opakovatelnost SPME a SBSE postupů při stanovení volných mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)

Tab. 3 Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro nižší a vyšší mastné kyseliny

Opakovatelnost metod byla zjištěna pětinásobným opakováním celého postupu během jednoho dne na jednom a témž vzorku piva. Z výsledků uvedených v tab. 2 je vidět, že pro kyseliny kapronovou a kaprylovou byla hodnota relativní směrodatné odchylky (RSD) zhruba dvakrát horší při použití metody SBSE než u SPME postupu. To je zřejmě způsobeno jejich horší výtěžností. Naproti tomu u dalších homologických kyselin (kaprinová a laurová) jsou hodnoty RSD u obou postupů srovnatelné. Výrazně vyšší hodnoty opakovatelnosti (14,8–16,3 %) pro vyšší mastné kyseliny (myristovou – linolenovou) lze vysvětlit tím, že k jejich stanovení jsou ještě zapotřebí další dva kroky – derivatizace a následná extrakce methylesterů do hexanu. Každý z těchto kroků přispívá svým dílem k výsledné hodnotě RSD. Nicméně i tyto hodnoty RSD jsou plně akceptovatelné.

4 ZÁVĚR

Z výše uvedených výsledků je vidět, že pro stanovení mastných kyselin v pivu lze použít oba moderní postupy přípravy vzorků – SPME a SBSE. Obě techniky se vyznačují jednoduchostí, výbornou opakovatelností a žádnou nebo minimální spotřebou rozpouštědel.

Pro stanovení nižších mastných kyselin je vhodnější metoda SPME s vláknem potaženým fází typu Carbowax-Divinylbenzen. Pro tyto látky dosahuje toto SPME vlákno lepší výtěžnosti a opakovatelnosti než nepolární fáze Twisteru. Další nezanedbatelnou výhodou SPME postupu je jeho výrazně nižší časová náročnost (35 min oproti 160 min při použití SBSE metody). Na druhé straně značná nevýhoda spočívá v nemožnosti současného stanovení vyšších mastných kyselin v rámci jednoho extrakčního kroku.

Výhoda sorpční extrakce na míchací tyčince se zakládá na tom, že míchací tyčinka je podstatně robustnější než křehké SPME vlákno. Zacházení s SBSE je rovněž jednoduché, ale proces extrakce a následné reextrakce zabere podstatně více času.

Ačkoli obě techniky představují zaměnitelné alternativy, v případě požadavku na stanovení pouze nižších mastných kyselin v pivu je metoda SPME výhodnější. Pokud je nutno stanovit obsah jak nižších, tak vyšších mastných kyselin, bez problémů je možno využít techniku SBSE.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

EPA 8270 Re-optimized for Widest Calibration Range on the 5977 Inert Plus GC/MSD

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Solution for Environment & Agriculture Analysis

Brožury a specifikace
| 2020 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, GC/HRMS, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Životní prostředí, Potraviny a zemědělství

Analysis of VOCs in automotive trim components using TD-GC-MS

Aplikace
| 2020 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Termální desorpce, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific, Markes
Zaměření
Životní prostředí, Materiálová analýza
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Stanovení mastných kyselin v pivu rychlou, rutinní metodou

Tato práce popisuje stanovení mastných kyselin založené na technice extrakce na pevné fázi (SPE), rychlejší plynové chromatografie s kolonou o ID 0,18 mm a detekci pomocí plamenoionizačního detektoru (FID).
Vědecký článek | Potraviny

Extrakce na míchací tyčince – nová možnost při analýze některých senzoricky a aktivních látek v pivu

Tato práce se zabývá využitím SBSE při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu. Použita byla tyčinka (10 x 1,3 mm) pokrytá polydimethylsiloxanem od firmy Gerstel, komerčně nazývaná Twister.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení mastných kyselin v pivu technikou SPME

Předkládaná práce popisuje rychlou a jednoduchou možnost selektivního stanovení volných mastných kyselin (C6-C12) v pivu nebo mladině použitím mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a plynové chromatografie.
Vědecký článek | Potraviny

Využití některých moderních extrakčních postupů pro kvantitativní stanovení vicinálních diketonů v pivu.

Práce se zabývá vývojem a optimalizací metody sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE), porovnání s parametry mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a analýzy na plynovém chromatografu vybaveném ECD detektorem.
Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu
St, 25.3.2020
| Originální článek z: Kvasný průmysl
Tato práce se zabývá využitím technik mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) pro stanovení mastných kyselin v pivu.

Pixabay/Bruno Marques Bru: Možnosti využití moderních metod přípravy vzorků pro plynově chromatografické analýzy při analýze nápojů a zejména piva. Část 3. - Mikroextrakce na pevné fázi a extrakce na míchací tyčince při analýze mastných kyselin v pivu.

Mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) patří mezi moderní a jednoduché postupy přípravy vzorků. Tato práce se zabývá využitím těchto technik pro stanovení mastných kyselin v pivu. Zatímco z SPME vlákna byly analyty uvolněny termální desorpcí ve vyhřátém injektoru plynového chromatografu vybaveného křemennou kapilární kolonou ZB-WAX a plamenoionizačním detektorem, tak z míchací tyčinky byly vyextrahované látky uvolněny po zpětné extrakci do malého množství rozpouštědla a pak stanoveny na plynovém chromatografu. Kromě pracovních charakteristik obou postupů jsou uvedeny výhody a omezení těchto metod.

1 ÚVOD

Mastné kyseliny jsou jednou ze skupin látek, které mohou ovlivnit senzorické vlastnosti piva. Kromě toho mohou mít vliv na vitalitu kvasinek a také na stabilitu pivní pěny (1-3).

Nasycené mastné kyseliny (hexanová – dekanová kyselina) vznikají během kvašení (4). Tyto kyseliny se vyznačují žluklým nebo kozím aroma. Senzorické příspěvky těchto kyselin jsou kumulativní. Proto se tedy tyto cizí příchutě mohou projevit i tehdy, když koncentrace žádné z těchto kyselin nepřesahuje prahovou hodnotu vnímání (5). Obsah vyšších mastných kyselin jako je kyselina linolová a linolenová je významný z toho hlediska, že jejich oxidativní degradací může dojít ke vzniku typické staré chuti (6).

Z těchto důvodů je nutné mít k dispozici vhodnou analytickou metodu umožňující rychlé stanovení mastných kyselin v pivu. Mastné kyseliny se obvykle stanovují metodou plynové chromatografie. Při přípravě vzorků je možné namísto dříve používaných postupů založených na destilaci s vodní párou (7,8) nebo modernějších postupů využívajících extrakci na pevné fázi (9,10) s výhodou použít moderní metody jako je mikroextrakce na pevné fázi nebo sorpční extrakce na míchací tyčince.

Princip a využití mikroextrakce na pevné fázi (SPME) v pivovarské analytice bylo popsáno v úvodním článku této série (11). Teorie a možnosti praktického uplatnění sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE) jsou popsány v následující práci (12).

V této práci jsou na konkrétním příkladě stanovení volných mastných kyselin v pivu ukázány možnosti dvou mikroextrakčních technik – SPME v headspace uspořádání a SBSE s následnou zpětnou extrakcí do organického rozpouštědla. Jsou diskutovány výhody a nevýhody obou postupů a také porovnány pracovní charakteristiky výše zmíněných metod.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie, standardy

Ethanol, síran amonný – Lach – Ner, s. r. o., ČR; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a syntetický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.

Kyselina hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), cis-9-oktadekanová (olejová), cis-9,cis-12-oktadekadienová (linolová) a cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová (linoleová) a derivatizační činidlo BF3 v 10% methanolu byly nakoupeny od Sigma-Aldrich, USA.

Vzorky piva plzeňského typu, vyrobené a balené v České republice, byly zakoupeny v běžné maloobchodní síti.

2.2 Podmínky plynové chromatografie

Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveném split/splitless injektorem a plamenoionizačním detektorem. K separaci byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-Wax firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při 75 °C.

2.3 Headspace SPME

K extrakci bylo použito SPME vlákno s fází typu Carbowax-Divinylbenzen o tloušťce vrstvy 65 μm. Vlákno bylo umístěno v manuálním držáku pro SPME vlákna a vše bylo zakoupeno od Supelco, USA.

Vzorky piva byly před analýzou vychlazeny na 4 °C. Všechny pokusy vedoucí k porovnání pracovních charakteristik byly prováděny na modelovém roztoku 5 % obj. ethanolu ve vodě. Před použitím bylo vlákno kondicionováno v injektoru plynového chromatografu při teplotě 250 °C po dobu 30 min. Extrakce byla založena na podmínkách popsaných Horákem a kol. (13).

Extrakce byla prováděna v headspace prostoru nad 4 ml vzorku obohaceného přídavkem kyseliny heptanové a undekanové, které byly využity jako vnitřní standardy (výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l), ve skleněné vialce o objemu 20 ml uzavřené septem krytým hliníkovou fólií. K podpoře extrakce bylo využito vysolení pomocí 1,0 g síranu amonného. Před zahájením SPME extrakce byla vialka se vzorkem intenzivně třepána po dobu 10 s. Extrakce probíhala za laboratorní teploty po dobu 30 min.

Po extrakci bylo vlákno termálně desorbováno při teplotě 250 °C v nástřikovém prostoru plynového chromatografu po dobu 5 min. Injektor plynového chromatografu byl osazen linerem o vnitřním průměru 0,75 mm. Podmínky chromatografické separace jsou popsány v kap. 2.2.

2.3 Analýzy metodou SBSE

K extrakci byla použita míchací tyčinka o délce 10 mm a vnějším průměru 3,2 mm pokrytá polydimethylsiloxanovou (PDMS) vrstvou o tloušťce 0,5 mm. Tato míchací tyčinka pod komerčním názvem Twister byla zakoupena od Gerstel, Německo.

Twister byl před použitím kondicionován ve skleněné trubičce při teplotě 300 °C po dobu 60 min v atmosféře helia o průtoku 50 ml/min. Mastné kyseliny byly vyextrahovány vložením Twisteru do 10 ml vzorku obohaceného vnitřními standardy (kyseliny heptanová, undekanová, tridekanová a pentadekanová – výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l) v 20 ml skleněné vialce. Vialka byla uzavřena víčkem s PTFE/silikonovým septem. Extrakce probíhala za podmínek popsaných Horákem a kol. (14). Twisterem bylo mícháno rychlostí 1000 ot/min po dobu 60 min za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister pomocí pinzety vyndán ze vzorku, krátce opláchnut destilovanou vodou a osušen buničitou vatou. Pro zpětnou extrakci do rozpouštědla byl poté Twister vložen do insertu o objemu 350 μl obsahujícím 200 μl rozpouštědla dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Insert byl vložen do vialky o objemu 2 ml a uzavřen PTFE/silikonovým septem a vložen na míchadlo při 1000 ot/min po dobu 40 min.

Ke stanovení nižších mastných kyselin (C6 – C12) byly 2 μl výše získaného extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu a separace proběhla za podmínek popsaných v kap. 2.2.

Ke stanovení vyšších mastných kyselin bylo nutné získaný SBSE extrakt odpařit pod jemným proudem dusíku a derivatizovat methylací pomocí 0,1 ml BF3 v 10% methanolu po dobu 20 min při teplotě 95 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 0,1 ml vody. Methylestery vyšších mastných kyselin byly extrahovány do 0,1 ml hexanu v ultrazvukové lázni po dobu 2 min (15). Podmínky chromatografické separace byly stejné jako při stanovení nižších mastných kyselin.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro všechny stanovované volné mastné kyseliny byla proměřena kalibrační křivka v rozsahu koncentrací běžných pro pivo plzeňského typu (0,0015 mg/l až 8 mg/l) v 5 % obj. roztoku ethanolu. Jak vyplývá z tab. 1, lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty nižších mastných kyselin při použití lineární regrese ležely pro metodu SPME v rozmezí 0,9951 až 0,9983, pro SBSE extrakci v rozmezí 0,9919 až 0,9995. Při aplikaci kvadratické křivky rozsah hodnot korelačních koeficientů byl od 0,9956 do 0,9993 pro SPME postup, respektive od 0,9931 do 0,9993 pro SBSE metodu.

Tab. 1 Korelační koeficienty pro stanovení volných mastných kyselin v pivu pomocí metody SPME a SBSE

Vzhledem k tomu, že při použití metody SPME dochází v injektoru plynového chromatografu k termální desorpci všech analytů vyextrahovaných na SPME vlákno, nelze tímto postupem v rámci jednoho extrakčního kroku stanovit jak nižší, tak vyšší mastné kyseliny. Ke stanovení vyšších mastných kyselin by bylo nutné SPME extrakci opakovat. Následná derivatizace vyšších mastných kyselin přímo na vlákně je sice možná, ale použití, respektive manipulace s diazomethanovým činidlem není úplně bezproblémové (16). Z tohoto důvodu byly vyšší mastné kyseliny stanoveny jen SBSE postupem. Korelační koeficienty pro tyto kyseliny leží v intervalu 0,9981–0,9998 v případě lineární regrese a v rozmezí 0,9994–0,9997 při použití kvadratické křivky.

Z výsledků je patrné, že obě metody se v daném koncentračním rozmezí vyznačují vysokou linearitou.

Správnost metod byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v pěti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Výtěžnost SPME metody se nacházela v rozmezí 95–110 %. U metody SBSE byla výtěžnost nižších mastných kyselin podstatně horší (57–89 %). Příčina této malé výtěžnosti spočívá pravděpodobně v tom, že jako extrakční fáze je použita nepolární polydimethylsiloxanová vrstva Twisteru, do níž se tyto polární (zejména kyselina kapronová) nižší mastné kyseliny extrahují obtížně. Extrakci látky z kapalné fáze do extrakční fáze je možné, i když ne úplně přesně, popsat pomocí rozdělovacího koeficientu oktanol-voda (Ko/w) (17,18). Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro stanovované látky jsou uvedeny v tab. 3. Podle práce Baltussen a kol. (19) budou Twisterem kvantitativně vyextrahovány látky s Ko/w větším než 500 (odpovídá log Ko/w > 2,70). Hodnota log Ko/w pro kyselinu kapronovou je pouze 1,88, což naznačuje, že tato látka se bude obtížně extrahovat. Experimentálně dosažená výtěžnost 57 % pro tuto kyselinu tento teoretický předpoklad potvrzuje. Výtěžnosti vyšších mastných kyselin, jejichž log Ko/w > 6,10, dosahovaly podle očekávání vysokých hodnot 94–110 %.

Tab. 2 Výtěžnost a opakovatelnost SPME a SBSE postupů při stanovení volných mastných kyselin v pivu (CV – variační koeficient)

Tab. 3 Hodnoty rozdělovacích koeficientů oktanol-voda pro nižší a vyšší mastné kyseliny

Opakovatelnost metod byla zjištěna pětinásobným opakováním celého postupu během jednoho dne na jednom a témž vzorku piva. Z výsledků uvedených v tab. 2 je vidět, že pro kyseliny kapronovou a kaprylovou byla hodnota relativní směrodatné odchylky (RSD) zhruba dvakrát horší při použití metody SBSE než u SPME postupu. To je zřejmě způsobeno jejich horší výtěžností. Naproti tomu u dalších homologických kyselin (kaprinová a laurová) jsou hodnoty RSD u obou postupů srovnatelné. Výrazně vyšší hodnoty opakovatelnosti (14,8–16,3 %) pro vyšší mastné kyseliny (myristovou – linolenovou) lze vysvětlit tím, že k jejich stanovení jsou ještě zapotřebí další dva kroky – derivatizace a následná extrakce methylesterů do hexanu. Každý z těchto kroků přispívá svým dílem k výsledné hodnotě RSD. Nicméně i tyto hodnoty RSD jsou plně akceptovatelné.

4 ZÁVĚR

Z výše uvedených výsledků je vidět, že pro stanovení mastných kyselin v pivu lze použít oba moderní postupy přípravy vzorků – SPME a SBSE. Obě techniky se vyznačují jednoduchostí, výbornou opakovatelností a žádnou nebo minimální spotřebou rozpouštědel.

Pro stanovení nižších mastných kyselin je vhodnější metoda SPME s vláknem potaženým fází typu Carbowax-Divinylbenzen. Pro tyto látky dosahuje toto SPME vlákno lepší výtěžnosti a opakovatelnosti než nepolární fáze Twisteru. Další nezanedbatelnou výhodou SPME postupu je jeho výrazně nižší časová náročnost (35 min oproti 160 min při použití SBSE metody). Na druhé straně značná nevýhoda spočívá v nemožnosti současného stanovení vyšších mastných kyselin v rámci jednoho extrakčního kroku.

Výhoda sorpční extrakce na míchací tyčince se zakládá na tom, že míchací tyčinka je podstatně robustnější než křehké SPME vlákno. Zacházení s SBSE je rovněž jednoduché, ale proces extrakce a následné reextrakce zabere podstatně více času.

Ačkoli obě techniky představují zaměnitelné alternativy, v případě požadavku na stanovení pouze nižších mastných kyselin v pivu je metoda SPME výhodnější. Pokud je nutno stanovit obsah jak nižších, tak vyšších mastných kyselin, bez problémů je možno využít techniku SBSE.

Kvasný průmysl
 

Mohlo by Vás zajímat

EPA 8270 Re-optimized for Widest Calibration Range on the 5977 Inert Plus GC/MSD

Aplikace
| 2019 | Agilent Technologies
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ
Výrobce
Agilent Technologies
Zaměření
Životní prostředí

Solution for Environment & Agriculture Analysis

Brožury a specifikace
| 2020 | LECO
Instrumentace
GCxGC, GC/MSD, GC/HRMS, GC/TOF
Výrobce
LECO
Zaměření
Životní prostředí, Potraviny a zemědělství

Analysis of VOCs in automotive trim components using TD-GC-MS

Aplikace
| 2020 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, Termální desorpce, GC/SQ
Výrobce
Thermo Fischer Scientific, Markes
Zaměření
Životní prostředí, Materiálová analýza
 

Podobné články

Vědecký článek | Akademie

Stanovení mastných kyselin v pivu rychlou, rutinní metodou

Tato práce popisuje stanovení mastných kyselin založené na technice extrakce na pevné fázi (SPE), rychlejší plynové chromatografie s kolonou o ID 0,18 mm a detekci pomocí plamenoionizačního detektoru (FID).
Vědecký článek | Potraviny

Extrakce na míchací tyčince – nová možnost při analýze některých senzoricky a aktivních látek v pivu

Tato práce se zabývá využitím SBSE při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu. Použita byla tyčinka (10 x 1,3 mm) pokrytá polydimethylsiloxanem od firmy Gerstel, komerčně nazývaná Twister.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení mastných kyselin v pivu technikou SPME

Předkládaná práce popisuje rychlou a jednoduchou možnost selektivního stanovení volných mastných kyselin (C6-C12) v pivu nebo mladině použitím mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a plynové chromatografie.
Vědecký článek | Potraviny

Využití některých moderních extrakčních postupů pro kvantitativní stanovení vicinálních diketonů v pivu.

Práce se zabývá vývojem a optimalizací metody sorpční extrakce na míchací tyčince (SBSE), porovnání s parametry mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a analýzy na plynovém chromatografu vybaveném ECD detektorem.
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.