Procesní kontaminant 3-MCPD ve sladu

Sloučenina 3-MCPD (3-chlorpropan-1,2-diol) je procesní kontaminant vznikající při zpracování potravin, především při hydrolýze bílkovin. Tato látka se může vyskytovat v řadě dalších potravin vyrobených bez hydrolýzy, např. v tepelně upravených cereáliích (sladu, pečivu). Jako prekurzory vzniku 3-MCPD se zde pravděpodobně uplatňují endogenní lipidy obilovin a chloridové ionty. 3-MCPD je klasifi kován jako možný lidský karcinogen, pro který byl stanoven tolerovatelný denní příjem (TDI) ve výši 2 μg/kg tělesné hmotnosti. Obsah 3-MCPD byl sledován v různých druzích sladu. Analýza obsahu 3-MCPD ve vzorcích sladu byla provedena metodou plynové chromatografi e s hmotnostním detektorem. Mez stanovení obsahu 3-MCPD v analyzovaných vzorcích sladu byla 10 μg.kg⁻¹. Kombinovaná standardní nejistota metody byla 13 %.

1 ÚVOD

V současné době je kladen vysoký důraz na kvalitu a bezpečnost potravin. Bylo zjištěno několik toxických látek, které se přirozeně v potravinách nevyskytují, ale které v nich mohou vznikat během jejich technologického a především tepelného zpracování. Jedná se o tzv. procesní kontaminanty. Jednou z takových látek je i 3-MCPD.

3-chlorpropan-1,2-diol (3-MCPD) je bezbarvá kapalina s příjemnou vůní snadno rozpustná ve vodě a etanolu s bodem varu 213 °C. Její relativní molekulová hmotnost je 110,54 g.mol⁻¹ (WHO, 2013). Patří do skupiny chlorhydrinů glycerolu nebo také chlorpropanolů. Mezi nejčastěji se vyskytující chlorpropanoly patří kromě 3-MCPD také 1,3-dichlor-2-propanol (1,3-DCP). Nalezeny byly ale i 2-chlor-1,3-propandiol (2-MCPD) a 2,3-dichlor-1-propanol (2,3-DCP). Dále byly v potravinách objeveny monoestery a diestery chlorpropanolů, kde jsou jedna nebo dvě hydroxylové skupiny acylovány zbytkem mastné kyseliny (Patočka a Andělová, 2012).

Poprvé byly 3-MCPD a další chlorpropanoly objeveny v bílkovinném hydrolyzátu v roce 1978 (Velíšek a Hajšlová, 2009) a od té doby jsou zkoumány jako potenciální karcinogeny a mutageny (Kocourek a Hajšlová, 2007).

Chlorpropanoly vznikají v potravinách, které současně obsahují vyšší obsah tuků a soli, mají nízkou aktivitu vody a jsou vystavené působení vyšších teplot (Kocourek a Hajšlová, 2007). Prekurzorem pro vznik chlorpropanolů v potravinách jsou tuky. Především to jsou tři lipidické složky: triacylglyceroly, fosfolipidy a glycerol. Nezbytná je přítomnost chloridů, které jsou v podobě soli přítomné téměř v každé potravině. Primárními produkty reakcí mezi těmito složkami jsou diestery MCPD, které se hydrolyzují na monoestery MCPD. Reakcí esterů MCPD s chloridy vznikají estery DCP a volné chlorpropanoly následně vznikají hydrolýzou esterů (Patočka a Andělová, 2012).

Největší množství 3-MCPD bylo nalezeno v bílkovinných hydrolyzátech připravených kyselou hydrolýzou, tedy ve výrobcích jako sójová nebo ústřicová omáčka (Lee a Khor, 2015). Dále byl stanoven i v širokém spektru dalších potravin jako jsou sušenky, pekařské výrobky, káva, výrobky z masa a ryb, polévky, uzené výrobky a v některých tradičních přísadách jako jsou speciální tmavé slady, upravené škroby a extrakty masa. V menším množství se chlorpropanoly nacházejí i v tavených a grilovaných sýrech a fermentovaných salámech (tab. 1).

Velké množství 3-MCPD se nachází v chlebové kůrce (až 400 μg.kg⁻¹). Důvodem je vysoká teplota, které je vystavena právě tato část chleba během pečení. Podobně je tomu i u opékaných toustů, kde je ale vysoké teplotě vystavena větší plocha než u klasického chleba, a tudíž je zde riziko vyššího příjmu 3-MCPD (Baer et al., 2010).

3-MCPD byl nalezen v pražené kávě a ve větším množství v instantní kávě. Za tvorbu 3-MCPD během pražení je zodpovědné složení zrna, které přirozeně obsahuje chlorid sodný a lipidy. (Baer et al., 2010)

3-MCPD se může nacházet v pečeném masu a v masných výrobcích (salámy, slanina, šunky atd.). 3-MPCD se netvoří, pokud je maso upraveno vařením ve vodě nebo v páře. Pravděpodobně je pro jeho tvorbu nezbytná teplota nad 100 °C a nepřítomnost vody.

Další potravinou, ve které byl ve studii uskutečněné v Německu nalezen 3-MCPD, je uzené maso. Množství kontaminantu v tomto případě záviselo na délce uzení a na druhu použitého dřeva. U uzených výrobků vzniká 3-MCPD v tzv. tekutém kouři z prekurzoru 3-hydroxyacetonu, který vzniká při pyrolýze celulosy (Baer et al., 2010; Velíšek a Hajšlová, 2009).

Výrobky ze sladu jako jsou např. sladová zrna, sladová mouka, sladové extrakty a výrobky určené pro barvení a dochucování obsahují nezanedbatelné množství 3-MPCD. Kontaminant tady pravděpodobně vzniká při sušení za vyšších teplot.

Z uvedeného přehledu je zřejmé, že 3-MCPD se vyskytuje ve všech potravinách v nezanedbatelném množství. Z tohoto důvodu je nutné mít vhodnou analytickou metodu ke sledování obsahu 3-MCPD v rizikových potravinách.

Ačkoli má 3-MCPD jednoduchou strukturu, jeho vlastnosti jako je absence vhodného chromoforu, vysoký bod varu a nízká molekulová hmotnost, ztěžují provedení analýzy. Vhodné je použití spojení plynové chromatografi e s hmotnostní detekcí (GC/MS) za použití derivatizace. Nejpoužívanější deriváty pro toto stanovení jsou cyklické deriváty vytvořené reakcí s kyselinou fenylboritou nebo butylboritou, dále deriváty s heptafl uorobutyrylimidazolem (HFBI) nebo cyklické deriváty ketonů (WHO, 2013).

2 MATERIÁL A METODY

Ke stanovení obsahu 3-MCPD, po předchozí derivatizaci fenylborovou kyselinou, ve vzorcích sladu byla použita optimalizovaná metoda plynové chromatografi e s hmotnostním detektorem.

2.1 Použité chemikálie a přístroje

3-MCPD (Sigma – Aldrich, USA), 3-MCPD-d5 (Sigma – Aldrich, USA), fenylborová kyselina (PBA), purum ≥97 % (Sigma – Aldrich, USA), chlorid sodný, p. a. (Merck, Německo), aceton a hexan v čistotě pro HPLC (Sigma – Aldrich, ČR), deionizovaná voda.

Pro stanovení obsahu 3-MCPD v analyzovaných vzorcích byl použit plynový chromatograf Trace GC Ultra Finnigan, kombinovaný s hmotnostním detektorem Trace DSQ Thermo Finnigan. Separace byla provedena na kapilární koloně SLB-5MS (délka kolony 60 m x 0,25 mm vnitřní průměr, tloušťka fi lmu 0,25 mm; Supelco, USA), jako nosný plyn bylo použito helium o čistotě 5.5.

2.2 Vzorky

Celkem bylo analyzováno 22 vzorků sladu vyrobeného ve sladovnách v České republice. Slad světlý plzeňský – 8 vzorků, slad mnichovský – 4 vzorky, slad pšeničný světlý – 2 vzorky, slad karamelový světlý – 4 vzorky a slad barvicí – 4 vzorky.

2.3 Příprava vzorků pro GC/MSD

K pomletému vzorku sladu (cca 5 g) byl přidán vnitřní standard (3-MCPD-d5) a 30 ml směsi hexan / aceton (1: 1, v / v). Vzniklá směs byla homogenizována 1 min tyčovým homogenizátorem a následně extrahována 20 min v ultrazvukové lázni. Po extrakci byl homogenát kvantitativně převeden do centrifugačních zkumavek a odstředěn. Supernatant byl přenesen do dělicí nálevky obsahující 10 ml vody. Po extrakci byla spodní vodná vrstva oddělena a organická vrstva byla znovu extrahována 10 ml vody. Spojené vodné extrakty byly odpařeny ve vakuu při teplotě 55 °C do sucha. Zbytek po odpaření byl rozpuštěn ve 2 ml 20% roztoku chloridu sodného. Vzorek byl přenesen do 10ml vialky, bylo přidáno 0,4 ml roztoku PBA a vialka byla uzavřena septem. Derivatizace probíhala 20 min při 90 °C. Po vychlazení na laboratorní teplotu byly přidány 2 ml hexanu a vzorek byl protřepán. Hexanová fáze obsahující derivát 3-MCPD byla analyzována GC/MS.

2.4 Analýza vzorků pomocí GC/MSD

Pro stanovení obsahu derivátů 3-MCPD v analyzovaných vzorcích byl použit plynový chromatograf Trace GC Ultra Finnigan, kombinovaný s hmotnostním detektorem Trace DSQ Thermo Finnigan. K separaci byla použita kapilární kolona SLB-5MS (délka kolony 60 m x 0,25 mm vnitřní průměr, tloušťka fi lmu 0,25 mm). Teplota injektoru byla 250 °C (splitless), teplota kolony byla naprogramována od 80 °C (1 min) do 250 °C (37 minut) s gradientem 10 °C.min⁻¹. Průtok nosného plynu helia byl 1,5 ml.min-1, nástřik vzorku 1 ml.

Hmotnostně selektivní detektor pracoval v SIM módu, s pozitivní elektron impakt (EI) ionizací. Identifi kace a kvantifi kace derivátů 3-MCPD byla provedena na základě retenčního času a specifi ckých iontů m/z 91, 147, 196 (3-MCPD) a m/z 93, 150, 201 (3-MCPD-d5). Ionty m/z 91 a 196 (3-MCPD) a m/z 93 a 201 (3-MCPD-d5) byly použity pro kvalitativní analýzu. Kvantifi kace byla provedena pomocí kalibrační křivky (ionty m/z 147 (3-MCPD) a m/z 150 (3-MCPD-d5)).

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Připravené vzorky byly analyzovány na plynovém chromatografu s hmotnostním detektorem. Kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky (obr. 1), která byla lineární v rozmezí 6,9 –1030 μg.kg⁻¹ (r2 = 0,9999). Lineární rozsah byl dostatečný pro analýzu reálných vzorků. Mez stanovení (LOQ) 3-MCPD ve vzorcích sladu metodou GC/MSD byla 10 μg.kg⁻¹ a mez detekce (LOD) 3 μg.kg⁻¹. Výtěžnost extrakcí vzorků se pohybovala v rozmezí 75 až 80 %. Kombinovaná standardní nejistota metody byla 13 %. Výsledky obsahu 3-MCPD v analyzovaných vzorcích uvádí tab. 2.

Obsah 3-MCPD ve sladech se pohyboval v intervalu <10,0 – 95,0 μg.kg⁻¹. Ve světlých plzeňských sladech, sladech mnichovských a ve sladech pšeničných světlých byl obsah 3-MCPD pod mezí stanovení. Tyto hodnoty jsou podstatně nižší, než uvádí literatura (Velíšek a Hajšlová, 2009) a tato skutečnost je pravděpodobně způsobena jinou technologií sladování. V karamelových světlých sladech byly hodnoty 3-MCPD v intervalu <10,0 – 15,0 μg·kg⁻¹. Což jsou hodnoty, které ani nepřekročí stanovený maximální limit pro množství 3-MCPD v kyselých hydrolyzátech bílkovin a v sójových omáčkách, který je 20 μg.kg⁻¹ výrobku s 40 % sušiny (ES, 2006). Nejvyšší hodnoty 3-MCPD byly u barvicích sladů 55,0 – 95,0 μg · kg⁻¹ a korespondují s výsledky uváděnými v literatuře (Divinová et al., 2007).

4 ZÁVĚR

V této práci byl stanovován obsah 3-MCPD v různých typech sladů. Jednalo se o slady světlé (světlý plzeňský, mnichovský, pšeničný světlý a karamelový světlý) a slady barvicí. Pro analýzu byla použita metoda GC/MSD, před níž byl 3-MCPD derivatizován fenylborovou kyselinou.

Přítomnost 3-MCPD nebyla potvrzena ve světlých sladech. Vysoký obsah 3-MCPD byl stanoven pouze v barvicích sladech. Jedná se o výrobky, které jsou vystaveny velmi vysokým teplotám. Vznik kontaminantu při pražení a snížení jeho obsahu v barvicích sladech lze minimalizovat výběrem vhodných podmínek v procesu pražení sladu.

3-MCPD je na základě studií zařazen do 2A skupiny, jako potenciální lidský karcinogen. EFSA v roce 2001 stanovila maximální denní příjem (ADI) na 2 μg.kg⁻¹ tělesné hmotnosti.

V současné době existuje jediný legislativní limit, který stanovuje maximální hodnoty pro množství 3-MCPD v kyselých hydrolyzátech bílkovin a v sójových omáčkách 20 μg.kg⁻¹ výrobku s 40 % sušiny (ES, 2006). Evropskou komisí však bylo vydáno doporučení komise EU č. 2014/661 o monitorování hladin 2- a 3-MCPD a jejich esterů v potravinách, což dokládá závažnost dané problematiky nejen v ČR, ale i v rámci EU (EU, 2014).

Vzhledem k tomu, že ředění sladu při výrobě finálního produktu piva se pohybuje od 1:10 (tj. 1 kg sladu na 10 kg produktu) do 1:100 (Basařová a Čepička, 1985; Basařová, 2010), nepředstavuje obsah 3-MCPD ve světlých a barvicích sladech potenciální nebezpečí pro spotřebitele.