STANOVENÍ AROMATICKÝCH ALKOHOLŮ V PIVU S VYUŽITÍM METODY EXTRAKCE NA PEVNÉ FÁZI (SPE) A DETEKCE POMOCÍ SPOJENÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (GC-MS) Část I. – Vypracování a validace vhodné analytické metody

V úvodní části jsou krátce shrnuty poznatky týkající se analytických postupů stanovení aromatických alkoholů a doplněny o stručnou literární rešerši věnovanou jejich vzniku, úloze a senzorickým účinkům v pivu.

Na reálných vzorcích piv byl úspěšně odzkoušen postup izolace a zakoncentrování aromatických alkoholů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a metoda jejich stanovení pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC-MS).

1 ÚVOD

Se stoupajícími znalostmi o složení piva roste i počet sloučenin, ovlivňujících v menší či větší míře jeho senzorické vlastnosti. Koncentrace mnohých z nich překračují prahové hodnoty vnímání a podstatně ovlivňují chuť piva (vyšší alifatické alkoholy, diacetyl, estery nižších mastných kyselin), jiné se vyskytují ve velmi nízkých koncentracích, často se pohybujících pod prahovou hodnotou vnímání. Je však důležité si uvědomit, že teprve celkový soubor jejich účinků ovlivňuje výsledný senzorický profil piva a určuje tak jeho charakter. Mezi látky s významnými senzorickými vlastnostmi, jejichž počet již přesáhl 450, se bezesporu řadí i aromatické alkoholy, někdy též nazývané alkoholy fenolické. Na rozdíl od ostatních těkavých látek (esterů mastných kyselin, nižších a vyšších alifatických alkoholů) není o obsahu a senzorických vlastnostech aromatických alkoholů přítomných v pivu publikováno příliš mnoho informací. Cílem práce bylo proto vypracovat spolehlivou a rychlou metodu stanovení této skupiny látek v běžných pivech, ale i v pivech s nižším obsahem alkoholu a porovnat dosažené výsledky s výsledky dosud publikovanými. To umožní v budoucnu stanovit obsah aromatických alkoholů jako významných senzoricky aktivních látek, s vyšší citlivostí a přesností a případně zpřesnit nebo doplnit dosud udávané tabelární hodnoty jejich obsahů v pivu. Toto dále umožní dokonale definovat po analytické stránce senzorický profil piva a vyhodnotit dopad zvolených technologických zásahů při jeho výrobě.

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1 Aromatické alkoholy, jejich vznik, výskyt a významné senzorické vlastnosti

Hlavními představiteli aromatických alkoholů v pivu jsou 2-fenylethanol, guajakol a jeho deriváty 4-vinylguajakol a 4-ethylguajakol, eugenol, tyrosol a tryptofol (obr. 1).

Obr. 1 Hlavní zástupci aromatických alkoholů

Aromatické alkoholy 2-fenylethanol, tyrosol a tryptofol jsou obdobně jako vyšší alifatické alkoholy produkovány kvasinkami katabolickým nebo anabolickým procesem během kvašení. V případě procesu katabolického, kdy získává buňka energii rozkladem substrátu (mladiny), buňka přeměňuje aminokyseliny přítomné v mladině pomocí transaminačního cyklu za přítomnosti kyseliny α-ketoglutarové na příslušné α-ketokyseliny. Přebytek α-ketokyselin je dále dekarboxylován na aldehydy a ty jsou následně redukovány enzymem alkoholdehydrogenázou na alkoholy. Při procesu anabolickém jsou vyšší alkoholy naopak syntetizovány z α-ketokyselin vzniklých při syntéze aminokyselin z cukrů přítomných v mladině (1-5). Například 2-fenylethanol takto vzniká z fenylalaninu jeho deaminací a oxidativní dekarboxylací přes meziprodukt kyselinu fenylpyrohroznovou (6). Tyrosol obdobným způsobem z tyrosinu přes p-hydroxyfenylacetaldehyd (7). Na vznik 2-fenylethanolu mají podstatný vliv podmínky kvašení, tj. například imobilizace kvasničných buněk (8). Bylo zjištěno, že se na tvorbě vyšších alifatických alkoholů i 2-fenylethanolu podílí kvasinky i v průběhu zrání piva v ležáckém sklepě (6). Výše popsanými mechanismy lze objasnit vznik 2-methylpropanolu z valinu, 3-methylbutanolu z leucinu, 2-methylbutanolu z isoleucinu, 2-fenylethanolu z fenylalaninu, tryptofolu z tryptofanu a tyrosolu z tyrosinu. Avšak tvorbu některých alkoholů obsažených v pivu nebylo možné reakčním mechanismem navrženým Ehrlichem (1) vysvětlit, protože se odpovídající výchozí aminokyseliny nevyskytovaly v mladině.Také rychlost úbytku aminokyselin ze substrátu a tomu odpovídající přírůstky vyšších alkoholů a jejich finální obsah neodpovídal předpokladu, že by mohly být tyto aminokyseliny jediným zdrojem pro vznik vyšších alkoholů. Z výsledků výzkumných prací lze vyvodit, že produkce vyšších alkoholů souvisí také s metabolismem sacharidů (9-11). V současné době se tedy považují za prekurzory vyšších alkoholů zejména α-ketokyseliny, které jsou meziproduktem metabolismu aminokyselin i sacharidů.

Na obsah 2-fenylethanolu v pivu má dále vliv i použitý technologický postup při výrobě piva, například způsob jeho dealkoholizace (12) nebo průběh varu mladiny (13).

Zatímco přítomnost 2-fenylethanolu je v pivu vnímána spíše pozitivně, neboť se projevuje příjemnou květinovou vůní (po růžích), přítomnost guajakolu a jeho derivátů 4-ethyl a zejména 4-vinylguajakolu může při překročení běžných hodnot znamenat významný negativní vliv na výsledný senzorický profil piva. Za prekurzory těchto aromatických alkoholů jsou pokládány kyseliny p-kumarová, sinapová a zejména kyselina ferulová (14). V obilném zrnu jsou tyto látky vázány ve formě esterů nebo glykosidicky ve formě ferulovaných oligosacharidů (15). I když byl pozorován nárůst obsahu 4-vinylguajakolu termickým štěpením při výrobě barevných sladů (16), za příčinu jeho vyššího obsahu v pivu je pokládána ferulylesterázová aktivita kvasinek Saccharomyces cerevisiae (17). Obdobná enzymová aktivita byla pozorována i při produkci fenolických cizích vůní (POF) u vína způsobená nejen přítomností divokých kvasinek Saccharomyces cerevisiae, ale i zástupci jiných kmenů, např. Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Pichia a Brettanomyces (18). Při přípravě sladiny respektive mladiny mohou být volné fenolkarbonové kyseliny převedeny termální dekarboxylací (16) a následnými Maillardovými reakcemi na odpovídající fenoly, fenolethery, α-pyrony, což jsou látky, které jsou pokládány za látky zvyšující aroma. Proto byly detailně studovány změny obsahu 4-vinylguajakolu (19, 20) během varu mladiny. Dosud publikované poznatky týkající se vlivu technologických podmínek na vznik aromatických alkoholů včetně výsledků vlastního studia úlohy kvasničného kmene na vznik aromatických alkoholů v závislosti na podmínkách kvašení uvádějí Čulík et al. (21).

Základní údaje o běžném rozsahu koncentrací aromatických alkoholů ve světlých pivech, jejich prahových hodnotách a smyslové charakteristice jsou uvedeny v tab. 1 (22-25). Je zde však nutné uvést, že se od sebe různými autory uváděné hodnoty v některých případech značně liší, což je způsobeno nejen použitým analytickým postupem, ale i různými druhy piv.

Tab. 1 Běžné hodnoty obsahu vybraných aromatických alkoholů ve světlých pivech, jejich prahové hodnoty a smyslová charakteristika

2.2 Analýza aromatických alkoholů

Původně byly aromatické alkoholy stanovovány spektrofotometricky (26, 27). Izolace byla prováděna nejčastěji destilací vzorku piva (28). Metodu vhodnou pro selektivní stanovení 2-fenylethanolu publikoval Stevens (29). Tyrosol a tryptofol stanovil pomocí plynové chromatografie Nykanen (30). Protože platí, že dosažené výsledky v rozhodující míře ovlivňuje použitý izolační postup, byla původně běžně používaná destilační metoda modifikována a případně doplněna o další kroky, například přečištění na sloupci oxidu hlinitého (31). K extrakci byla vyzkoušena různá rozpouštědla jako například sirouhlík a hexanol (32), ethylacetát (33,34) nebo směs pentan-diethylether (14). V poslední době se však dostávají do popředí moderní separační postupy, mezi něž například patří extrakce na pevné fázi (SPE). Saegusa a kol. (35) izolovali guajakol společně s katecholem z moči extrakcí na kolonce plněné silikagelem (Extrelut 3). Využili derivatizační silylační postup a deriváty stanovili pomocí přístrojového spojení GC-MS. Kombinaci destilace s vodní párou a SPE použil Donhauser a kol. (36). Aromatické alkoholy a ostatní fenoly lze stanovit i ve formě jejich 2-4-dinitrofenylderivátů pomocí plynové kapilární chromatografie (37). Stále více nalézají v této oblasti uplatnění i metody využívající k detekci hmotnostní spektrometrii (GC-MS) ve spojení s koncentračními metodami, jako např. „purge and trap“ metodou (38) nebo metodou mikroextrakce na pevné fázi (SPME) (39). Velmi přesné výsledky, avšak za nesrovnatelně vyšších nákladů, lze získat metodou GC-MS využívající postup izotopového zřeďování, kdy se ke kvantifikaci přítomného analytu používají nejčastěji deuterované analogy stanovené látky (40, 41). Ke stanovení 4-vinylguajakolu lze použít i přístrojové spojení HPLC s fluorescenčním detektorem (FPLC-FD), kdy lze dosáhnout detekční limit 0,002 mg/l, nebo s elektrochemickým detektorem s poněkud horší mezí detekce okolo 0,01 mg/l (42). Obdobně použili při stanovení obsahu 2-fenylethanolu, tyrosolu a tryptofolu v pivu Li et al. (43) spojení HPLC s detektorem s diodovým polem (DAD, diode array detector).

Při stanovení obsahu 4-ethylfenolu a 4-ethylguajakolu ve víně byla použita i vysokoúčinná kapalinová chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS-MS) a kombinací detektoru s diodovým polem a detektoru fluorescenčního (DAD-FD) (44). Aromatické alkoholy lze však stanovit i takovými neobvyklými metodami, jako je například micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) (45) nebo metodou jednoduché nukleární rezonance (1H NMR) či dokonce dvoudimenzionální nukleární rezonance (2D NMR), schopných rozlišit od sebe i jednotlivé značky piv (46-48). Náklady na pořízení posledně jmenovaných přístrojů však řádově převyšují normální pořizovací náklady, a proto se tento způsob v běžné praxi zatím neuplatňuje.

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1 Extrakce aromatických alkoholů metodou SPE a jejich stanovení na přístrojovém spojení GC-MS

K extrakci aromatických alkoholů z piva byla použita metoda Čulíka et al. (49) pracující na principu SPE.Vlastní stanovení analytů bylo provedeno novým postupem pomocí přístrojového spojení GC-MS. Detailní údaje jsou uvedeny dále.

3.1.1 Použité přístroje, zařízení a chemikálie

Přístroje a zařízení:

• plynový chromatograf-MS: Trace GC Ultra – DSQ II
• data systém: Excalibur (GC-MS)
• sušárna KBC G – 100/250
• ultrazvuková lázeň Tesla
• lednice s mrazničkou
• membránová vývěva
• zařízení pro extrakci na pevné fázi (Supelco)
• stojan na zakoncentrování extraktů proudem dusíku
• pH meter PHM 84
• myčka nádobí Miele

Materiál:

• kónická zkumavka o objemu 10 ml s jemným kalibrováním do 1 ml
• centrifugační zkumavka o objemu cca 10 ml se zábrusem NZ 14/19
• kádinky 250 ml, 150ml
• pipeta o objemu 20 ml
• pipeta o objemu 1 ml
• odměrný válec o objemu 25 ml
• odměrný válec o objemu 50 ml
• kapilární kolona RTx-5Sil MS Integra Guard (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm)
• stříkačky (Hamilton) o objemu 10 μl, 100 a 500 μl
• odměrná baňka o objemu 10 ml se zábrusem a skleněnou zátkou
• odměrná baňka o objemu 50 ml se zábrusem a skleněnou zátkou
• nálevka
• skládaný filtrační papír

Chemikálie:

• ethanol, methanol, aceton p. a. (Lachema)
• ethylacetát (Merck)
• hydroxid sodný
• voda čištěná reversní osmosou na zařízení Millipore Milli-RO 5plus
• hélium o čistotě 5.0 Messer (pro GC-MS)
• dusík o čistotě 4.8
• extrakční (SPE) kolonky LiChrolut EN 200 mg (Merck)

Chromatografické standardy:

• guajakol, tryptofol, 4-ethylguajakol, 4-vinylguajakol, eugenol (Sigma- Aldrich)
• tyrosol, 4-ethylfenol, (Fluka)
• 2-fenylethanol (Merck)

3.1.2 Analytický postup stanovení aromatických alkoholů

Extrakční postup:

Přibližně 50 ml vzorku piva odplyníme v ultrazvukové lázni a pH vzorku upravíme přídavkem roztoku hydroxidu sodného (o koncentraci 10 mol/l) na hodnotu 8,5. Poté odměříme do zkumavky 10 ml takto upraveného vzorku a přidáme 0,1 ml roztoku vnitřního standardu (4-ethylfenolu) o koncentraci cca 30 mg/l.

Extrakční (SPE) kolonku LiChrolut EN 200 mg kondicionujeme na zařízení pro extrakci na pevné fázi následujícím způsobem. Kolonku promyjeme postupně 2 ml methanolu a poté 2 ml vody, jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 8,5. Po kondicionování nesmí kolonka vyschnout, a proto ihned na kolonku převedeme 10 ml vzorku upraveného výše popsaným způsobem. Průchod methanolu, vody i vzorku kolonkou je urychlen působením vakua z membránové vývěvy.Po průchodu vzorku kolonku propláchneme opět 2 ml vody (pH = 8,5). Vše jímáme do centrifugační zkumavky, jejíž obsah následně vyprázdníme do odpadu. Kolonku vyjmeme ze zařízení pro extrakci na pevné fázi a nasadíme na ústí ventilu na dusíkové lahvi.Mírným proudem dusíku po dobu asi 3 min kolonku vysušíme. Viditelné zesvětlení náplně je znakem dokonalého vysušení. Dále kolonku opět nasadíme do zařízení pro extrakci na pevné fázi a provedeme eluci 2 ml ethylacetátu. Prosátí kolonky provedeme vakuově pomocí membránové vývěvy. Eluát jímáme do kalibrované kónické zkumavky a dále bez zahuštění jeho část převedeme do vialky opatřené insertem a šroubovacím. Vialky se vzorky přechováváme v mrazáku při teplotě –18 °C.

Podmínky na přístrojovém spojení GC-MS

• GC podmínky: Spojení GC – MS (Trace GC Ultra – DSQ II)
• Kolona: RTx5-Sil MS Integra Guard, 30 m, 0,25 mm, 0,25 μm, (Restek) nebo alternativně CP-Sil 8 CB (50 m, 0,25 mm, 0,25 μm), (Chrompack)
• Injektor: 250 °C, splitless 1 min (split flow 50 ml/min), Objem nástřiku: 1 μl
• Teplota transfer line GC-MS: 250 °C
• Teplota zdroje MS: 200 °C
• Teplotní program pece pro kolonu CP-Sil 8 CB: 70 °C (3 min) –7 °C/min –150 °C (0 min) –10 °C/min –260 °C (2 min)
• Teplotní program pece pro kolonu RTx5-Sil MS: 70 °C (1 min) –17 °C/min – 155 °C (0 min) –25 °C/min –260 °C (2 min)

Kvantitativně byl obsah aromatických alkoholů stanoven v SIM módu. Základní údaje jsou uvedeny v tab. 2.

Tab. 2 Základní údaje o stanovených sloučeninách

3.1.3 Porovnání dělicí schopnosti kolon RTx5-Sil MS a CP-Sil 8 CB

Pro stanovení aromatických alkoholů byly zvoleny křemenné kapilární kolony smočené nepolární fází, tj. pouze s 5 % dimethylpolysiloxanu od dvou renomovaných výrobců (Restek a Chrompack). Z výsledků na obr. 2 a 3 je patrné, že se na 30 m koloně RTx5-Sil MS v porovnání s 50 m kolonou CP-Sil 8 CB, za totožných chromatografických podmínek, podařilo docílit lepších výsledků. Kolona RTx5-Sil MS vykazovala, kromě podstatného zkrácení doby analýzy, zejména v případě tyrosolu a tryptofolu, nižší chvostování jejich píků, a proto jí byla dána přednost. Přibližné retenční časy na této koloně jsou uvedeny v tab. 2.

Obr. 2 Chromatogram roztoku standardů aromatických alkoholů na koloně CPSil8-CB (konc. rozsah 10 až 20 mg/l)

Obr. 3 Chromatogram roztoku standardů na koloně RTx-5Sil MS (konc. rozsah 10 až 20 mg/l)

3.1.4 Měřicí rozsah stanovení

Proměřením koncentrační řady standardů byl stanoven měřicí rozsah stanovení aromatických alkoholů. S ohledem na skutečnost, že se obsah aromatických alkoholů v pivu liší až o několik řádů, bylo nutné ověřit, zda bude možné, s ohledem na předpokládaný dynamický rozsah hmotnostního detektoru (linearitu odezvy), využít ke kvantitativnímu vyhodnocení výsledky získané měřením extraktu bez potřeby jeho dalších úprav (ředění). Získané hodnoty pro oba typy kolon jsou uvedeny v tab. 3.

Tab. 3 Linearita stanovení

Lze tedy konstatovat, že je možné využít lineární kalibrační křivky v daném koncentračním rozsahu pro všechny stanovené látky.

3.1.5 Opakovatelnost a vnitrolaboratorní reprodukovatelnost

Opakovatelnost byla ověřena osminásobným opakovaným změřením reálného vzorku extraktu piva a vyjádřena jako variační koeficient, tj. podíl vypočtené směrodatné odchylky a výsledné průměrné hodnoty v procentech. Vnitrolaboratorní reprodukovatelnost byla stanovena tím způsobem, že ve dnech po sobě následujících připravili dva pracovníci čtyři paralelní extrakty jednoho vzorku a ty byly neprodleně změřeny. Výsledek byl vyjádřen obdobným způsobem jako v případě opakovatelnosti (tab. 4).

Tab. 4. Opakovatelnost a vnitrolaboratorní reprodukovatelnost (kolona RTx5-Sil MS)

3.1.6 Správnost a shodnost

Správnost a shodnost metody byla ověřena analýzou vzorků piva obohacených přídavkem aromatických alkoholů. K osmi vzorkům komerčního piva byl přidán přídavek analytů v desetinásobku odhadovaného přirozeného množství. Správnost (pravdivost) získaných hodnot byla ověřena na základě dosažených výtěžností jednotlivých analytů, shodnost byla vyhodnocena jako směrodatná odchylka souboru výsledků (RSD) stanovení za podmínek opakovatelnosti. Výsledky jsou uvedeny v tab. 5.

Tab. 5 Správnost a shodnost

3.1.7 Mez detekce a mez stanovení

Mez detekce (detekční limit na hladině pravděpodobnosti 95 %) a mez stanovení byla stanovena pomocí modulu ovládacího a vyhodnocovacího softwaru Excalibur pro GC-MS (Signal to Noise Caltulator) analýzou 10násobně a 100násobně zředěného standardního roztoku na koncentračních úrovních 0,01 a 0,001 mg/l. To odpovídá koncentračnímu rozmezí 0,002 a 0,0002 mg/l v reálném vzorku. Odhadnuté meze detekce a stanovení jsou uvedeny v tab. 6.

Tab. 6 Meze detekce a stanovení

3.2 Stanovení aromatických alkoholů v reálných vzorcích piv

Chromatogram reálného vzorku piva v TIC módu je uveden na obr. 4,v SIM módu pro 2-fenylethanol, 4-vinylguajakol, tyrosol a tryptofol na obr. 5. Je zde patrné, k jak výraznému zvýšení citlivosti a selektivity dojde, použijeme-li pro vyhodnocení SIM mód.

Obr. 4 Chromatogram reálného vzorku piva (TIC mód)

Obr. 5 Chromatogram reálného vzorku piva (SIM mód)

Nově navržená metoda stanovení obsahu aromatických alkoholů v pivech byla využita při mapování obsahu aromatických alkoholů v českých pivech, přičemž jsme vybrali skupiny piv tak, aby v nich byla zastoupena piva nealkoholická, světlá výčepní i ležáky od totožného výrobce. Získané výsledky budou zveřejněny v následujícím díle tohoto článku.

4 DISKUSE VÝSLEDKŮ

Výše popsaný způsob extrakce aromatických alkoholů ze vzorků piv pomocí metody SPE s následnou detekcí pomocí GC-MS lze pokládat pro účely běžné pivovarské kontroly za plně vyhovující. Na základě dosažených výsledků na obou porovnávaných kolonách lze s ohledem na získané chromatogramy konstatovat, že bylo dosaženo lepších výsledků na koloně RTx-5Sil MS (obr. 1 a 2). Linearita detektoru byla ve zvoleném koncentračním rozsahu plně vyhovující (tab. 2). Dosažená opakovatelnost měření (tab. 3), jeho správnost a shodnost (tab. 4), stejně jako dosažené meze detekce a stanovení u jednotlivých látek (tab. 5), potvrzují schopnost navrženého analytického postupu stanovit obsahy aromatických alkoholů v reálných vzorcích piv s dostatečnou citlivostí a správností.

Uvedený analytický postup byl dále využit při detailním studiu obsahu aromatických alkoholů v českých pivech, a to jak běžných výčepních a ležácích, tak i v pivech nealkoholických. Výsledky této studie budou zveřejněny v navazujícím díle na tento článek.

5 ZÁVĚR

V práci byl popsán nový analytický postup stanovení aromatických alkoholů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a jejich následné stanovení pomocí přístrojového spojení GC-MS splňuje náročné požadavky na analýzu těchto senzoricky významných látek v pivu. Je možné jej využít jako účinného nástroje ke studiu změn obsahu senzoricky aktivních látek, způsobených například technologickými zásahy při výrobě nealkoholického piva.