Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie

O nás

Naše laboratoř je vybavena špičkovými hmotnostními spectrometry a nabízíme služby v oblasti PROTEOMIKY a METABOLOMIKY.

Naše služby:

• Příprava vzorků pro analýzu (buňky, tělesné tekutiny, tkáně, rostliny atd.)
• Cílená nebo necílená proteomická a metabolomická analýza
• Analýza dat a základní statistické vyhodnocení
• Konzultace návrhu experimentu a výsledků

Naše služby jsou dostupné pro všechny z akademické i neakademické oblasti.

Před začátkem vašeho prvního experiment nás kontaktujte: +420 325 873 925!

23.7.2024 Čekací doba od „vzorku k výsledku“ je přibližně 6-8 týdnů.

Proteomika:

Jsme moderně vybavená laboratoř disponující technickým zázemím pro provedení většiny v současnosti používaných necílených a cílených proteomických měření. Zákazníkům poskytujeme plný proteomický servis zahrnující izolaci proteinů z dodaného vzorku až po vyhodnocení a konzultaci naměřených dat. Od roku 2015 odbavujeme zhruba 300 zakázek ročně (zhruba 3000 vzorků). Výsledky zakládající se na měření z naší laboratoře byly použity v desítkách publikací. Pro konzultaci Vašeho projektu kontaktujte prosím Karla Haranta nebo Pavla Talacka.

Metabolomika:

Servisně provádíme cílenou i necílenou analýzu malých molekul. Díky kombinaci vybavení pro LC-MS a GCxGC-MS je možné měřit široké spektrum látek. Na LC používáme několik druhů kolon se stacionární fází C18 a HILIC. Pro GC disponujeme rovněž kolonami pro různé typy analytů. Jednotlivá měření je vždy třeba předem konzultovat, pro každou skupinu látek je potřeba zvolit individuální přístup a metodu. Kontaktujte prosím Olgu Součkovou pro LC-MS nebo Petra Žáčka pro GCxGC-MS.

BIOCEV: OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie.

Služby

Naše laboratoř nabízí tyto služby:

• Příprava vzorků na analýzu
• Necílená a cílená proteomika
• Necílená a cílená metabolomika
• Analýza dat a základní statistické zpracování
• Konzultace návrhu experimentu a naměřených výsledků

Více informací v odkazu "SLUŽBY".

Necílená proteomika

Až 8000 identifikovaných proteinů v jednom nástřiku.

Základní typ proteomického experimentu. Pokud možno co nejkompletnější lyzát je štěpen trypsinem. Vzniklé peptidy jsou odsoleny a separovány na koloně s reverzní fází. Vzhledem k nízkým množstvím proteinů a vysoké komplexitě vzorku se v současnosti používá nejčastěji kapalinová chromatografie v nano průtoku - stovky nanolitrů za minutu. Kapalinová chromatografie je přímo spojena s elektrosprejem hmotnostního spektrometru Orbitrap Fusion nebo Orbitrap Ascend. Hmotnostní spektrometr meří střídavě ve dvou režimech: MS1 kdy jsou v Orbitrapu změřeny hmoty peptidů s vysokým rozlišením a přesností a MS2, ve kterém jsou fragmentovány peptidy vybrané z předchozího MS1 scanu. Ty jsou měřeny buď opět v Orbitrapu a nebo v iontové pasti. Iontová past poskytuje oproti Orbitrapu nižší přesnost a rozlišení, ale je rychlejší a citlivější.

Nabízíme měření necílené proteomiky a analýzu posttranslačních modifikací v různých typech vzorků (buňky, tkáně, tělní tekutiny, vzorky rostlin atd.).

Nově nabízíme "Thermal proteome profiling (TPP)", který umožňuje přímou detekci interakcí ligand-protein v živých buňkách.

Příklady analýz:

• LFQ (Label free quantification)
• TMT (tandem mass tags)
• TPP (Thermal proteome profiling)
• phosphoproteome profiling
• pull-down experiments

Tipy pro manipulaci se vzorky:

• nepoužívejte trypsin pro sklízení buněk
• informujte nás o přítomnosti detergentu
• dbejte na stejnou nanášku proteinu při pull-down experimentech (např. koimunoprecipitace)
• nepoužívejte inhibitory fosfatáz pro fosfoproteomické experimenty

Cílená proteomika

Přesná kvantifikace vybraných proteinů.

Cílená proteomika je experimet zaměřený na validaci výsledků necíleneného přístupu a měření probíhá na trojitém kvadrupólu v SRM módu (Thermo Quantiva) nebo s použitím MRM metody na Orbitrapu. Tento přístup je alternativou k běžným přístupům pro ověřování výsledků necíleného proteomického experimentu (western blot atd.). Výhodou tohoto přístupu je možnost analyzovat několik proteinů (řádově až desítky) najednou během jednoho nástřiku. Odpadá tak problém se sháněním vhodných protilátek.

Služba cílené proteomiky je vždy specifická pro každý projekt a nabízíme ji po předchozí domluvě se zákazníkem.

Nezbytností je paralelní analýza peptidů značených těžkými aminokyselinami. Ty slouží jako vnitřní standard.

Množství proteinů, které je možno cíleně analyzovat v jednom nástřiku za použití trojitého kvadrupólu, je silně závislé zejména na koncentraci cílových proteinů ve vzorku. Čím nižší je exprese cílových proteinů, tím méně je možné jich analyzovat v jednom nástřiku z důvodu potřeby vyšších plnících časů. Pro tento experiment je také důležitá informace o fragmentačních vlastnostech cílových peptidů. Ta je obvykle získávána z necíleného experimentu, který by měl cílené proteomické analýze předcházet. Pokud nebyl protein zájmu detekován během necíleného experimentu, pak je jeho cílená analýza velice obtížná. V některých případech je možné informace o fragmentaci získat z veřejně přístupných databází.

Tipy pro manipulaci se vzorky:

• nepoužívejte trypsin pro sklízení buněk
• informujte nás o přítomnosti detergentu
• dbejte na stejnou nanášku proteinu při pull-down experimentech (např. koimunoprecipitace)
• nepoužívejte inhibitory fosfatáz pro fosfoproteomické experimenty

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Cílená proteomika.

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Cílená proteomika.

Necílená metabolomika

Cílem necílené metabolomiky je pokrytí co nejširšího spektra metabolitů ve vzorku, jejich identifikace a kvantifikace. Rozvoj tohoto přístupu analýzy byl umožněn pokrokem v přístrojové technice a výpočetní technice. Vybavení naší laboratoře umožňuje provádět necílené analýzy metodami kapalinové a plynové chromatografie s hmotnostními spektrometry.

Nabízíme necílené analýzy metabolitů v různých biologických matricích a základní statistické vyhodnocení dat (Obrázek 2, 3, 4).

Naší nejnovější službou je stable isotope tracing (Obrázek 1).

HPLC-MS/MS (Obrázek 2): Analýzy provádíme na vybavení od společnosti Thermo Scientific na kapalinovém chromatografu Ultimate 3000 spojeného s hmotnostním detektorem Orbitrap Fusion. Naměřená data jsou vyhodnocována softwarem Compound Discoverer.

GCxGC-MS (Obrázek 3): Analýzy provádíme na dvourozměrném komprehensivním chromatografu spojeného s hmotnostním detektorem Pegasus 4D. Data vyhodnocujeme v softwaru ChromaTOF v4.5.

Metoda kapalinové chromatografie pokrývá látky netěkavé, obecně polární, rozpustné ve vodě a polárních organických rozpouštědlech (methanol, acetonitril...). Metoda plynové chromatografie je vhodnější pro analýzu stabilních těkavých nepolárních látek do hmotnosti cca 1000 Da. Rozsah měřených látek lze pro obě metody zvětšit například pomocí chemických modifikací (derivatizací) analyzovaných molekul, které upraví jejich polaritu a těkavost (pro GC) a nebo stabilitu (pro LC). Vhodnou techniku, nebo kombinace více technik volíme na základě předchozí konzultace se zákazníkem.

Výsledkem necílené analýzy je seznam nalezených látek ve vzorcích, návrh pravděpodobných struktur a údajů o kvantitě jednotlivých sloučenin. Rovněž poskytujeme základní statistické vyhodnocení se zaměřením na nalezení rozdílů mezi testovanými skupinami vzorků (Obrázek 4).

Tipy pro manipulaci se vzorky:

• nepoužívat ve vzorku fosfátové pufry
• informujte nás o tipu vzorku, růstového média, použitých chemikáliích atd.

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Necílená metabolomika - Obr. 1.

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Necílená metabolomika - Obr. 2.

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Necílená metabolomika - Obr. 3.

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Necílená metabolomika - Obr. 4.

Cílená metabolomika

Cílená metabolomika zahrnuje analýzy vybraných metabolitů, které jsou pak detekovány selektivně a s větší citlivostí, než při necíleném přístupu. Rovněž je možné látky kvantifikovat jako relativně, tak absolutně. V případě absolutní kvantifikace je nutné dodat vhodný značený analog stanovované látky.

Nabízíme analýzu primárních buněčných metabolitů - viz Seznam látek.

Metabolity analyzujeme v tkáních, buněčných peletách, inkubačních médiích a tělních tekutinách (plasma, moč...).

Dále nabízíme možnost vývoje metody pro analýzu látek, které nejsou v přiloženém seznamu, nebo pro jiné matrice.

Přiložený seznam obsahuje látky, s jejichž analýzou máme zkušenosti. Každou metodu přizpůsobujeme typu experimentu a matrici. V podstatě jsme schopni vyvinout metodu pro jakoukoliv látku, nebo skupinu, která může být detekovaná technikami kapalinové a plynové chromatografie (obě spojené s hmotnostním detektorem, nebo UV detektorem u kapalinové chromatografie). V případě vývoje nové metody je nutné dodání standardů těchto látek.

Tipy pro manipulaci se vzorky:

• nepoužívat ve vzorku fosfátové pufry
• informujte nás o tipu vzorku, růstového média, použitých chemikáliích atd.

BIOCEV: Představujeme BIOCEV OMICS Servisní oddělení hmotnostní spektrometrie - Cílená metabolomika - Seznam látek.

Vybavení

Hmotnostní spektrometry

Orbitrap Ascend

• Aplikace v knihovně LabRulezLCMS

Hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid nabízí nové možnosti pro multiplexní proteomiku a charakterizaci nativních proteinů. Tento přístroj umožňuje lepší propustnost vzorků, všestrannost a snadné použití – produkování vysoce kvalitních dat s jednoduchostí. Při nižších koncentracích lze analyzovat více vzorků, což umožňuje rychlejší a citlivější analýzu a nyní lze dosáhnout experimentů s makromolekulami, které dříve nebyly možné. Nový Auto-Ready iontový zdroj pro kalibraci maximalizuje pohodlí a umožňuje uživateli strávit více času na výsledcích a méně času na nastavování přístroje.

Orbitrap Fusion

• Aplikace v knihovně LabRulezLCMS

Hmotnostní spektrometr kombinující Quadrupól, Iontovou past a Orbitrap. Quadrupól je používán jako hmotnostní filtr pro výběr prekurzorů, za ním se přístroj větví a ionty mohou cestovat buď do Orbitrapu - velmi přesného a vysokorozlišovacího hmotnostního analyzátotu využívajícího pro určení jejich hmoty Fourierovu transformaci nebo do kolizní cely, kde mohou být fragmentovány. Odtud vede cesta buď zpět do Orbitrapu a nebo dále do lineární iontové pasti. Ta slouží jako druhý hmotnostní analyzátor v přístroji. Je méně přesná a nízkorozlišovací, poskytuje však větší citlivost a možnost fragmentace iontů. Produkty fragmentace mohou být v pasti izolovány a znovu fragmentovány. Tak je umožněna analýza v MS³ a i vyšších stupních fragmentace.

Trojitý quadrupól Thermo Quantiva

• Aplikace v knihovně LabRulezLCMS

Trojitý kvadrupól disponující vysokokapacitním iontovým zdrojem. První a třetí kvadrupól slouží jako hmotnostní filtry pro izolaci prekursoru respektive fragmentu. Druhý kvadrupól slouží jako argonová kolizní cela.

Minimální izolační okno prekurzoru 0,2Da zajištuje vysokou selektivitu. Je možné měřit až 500 přechodů za vteřinu. Přepínání polarity 25ms.

Leco - Pegasus® 4D GCxGC-TOFMS

• Aplikace v knihovně LabRulezGCMS

2D plynová chromatografie kombinovaná s TOF hmotnostním analyzátorem vybavená robotem pro nástřik a přípravu vzorků Gerstel.

Kapalinová chromatografie

• nano LC Thermo Dionex Ultimate 3000
• LC Thermo Dionex Ultimate 3000

Příprava vzorků

• KingFisher Flex
• Vakuová odparka
• Low flow fraction collector - Spider
• Bioruptor pico - sonikační lázeň

Software

• Spectronaut 19
• FreeStyle
• ChromaTOF 4.5
• Proteome Discoverer 2.2
• Scaffold Q+S 4.6.1
• Compound Discoverer 3.3
• TraceFinder

Software - volně dostupný

• LipidHunter
• MaxQuant
• Perseus
• Skyline

Tým

Mgr. Karel Harant

• Vedoucí proteomické servisní laboratoře

Mgr. Pavel Talacko

• Necílená proteomika, cílená proteomika

RNDr. Petr Žáček, Ph.D.

• GC/MS specialista, analýza malých molekul

Mgr. Veronika Ševců

• vědecký pracovník, příprava proteomických vzorků

Ing. Olga Součková, Ph.D.

• LC/MS specialista, analýza malých molekul