Stanovení mastných kyselin v pivu rychlou, rutinní metodou

Mastné kyseliny v pivu pocházejí jednak z použitých surovin a jednak vznikají při kvašení a zrání piva. Vysoký obsah mastných kyselin v kvasném médiu může nepříznivě ovlivnit výslednou kvalitu piva. Proto je nutné mít k dispozici rychlou, rutinní metodu k jejich stanovení. Tato práce popisuje postup vyhovující těmto požadavkům pomocí metody stanovení mastných kyselin v pivu nebo mladině založené na technice extrakce na pevné fázi (SPE). K vlastnímu stanovení mastných kyselin bylo použito rychlejší plynové chromatografie s křemennou kapilární kolonou o vnitřním průměru 0,18 mm. K detekci byl použit plamenoionizační detektor (FID). V práci jsou uvedeny pracovní charakteristiky předloženého postupu.

1 ÚVOD

Na senzorických vlastnostech piva se podílí velké množství těkavých a netěkavých látek, které pivo obsahuje. Mnoho těchto látek produkují kvasinky během fermentace. Jednou z těchto senzoricky aktivních skupin látek jsou mastné kyseliny. Mají vliv na vitalitu kvasnic, mohou ovlivnit chuť piva a také stabilitu pivní pěny (Chen, 1980; Drost et al., 1971; Clapperton, 1978a).

Nižší mastné kyseliny, jako je kyselina hexanová, oktanová a dekanová, jsou vytvářeny kvasnicemi při fermentaci během biosyntézy vyšších mastných kyselin. Jejich vznik ovlivňuje celá řada faktorů. Mezi nejvýznamnější patří stres kvasnic, složení mladiny a stupeň provzdušnění. Nižší mastné kyseliny jsou odpovědné za žluklou nebo kozí pachuť (Clarke et al., 1981).

Příspěvek těchto kyselin k celkovému arómatu je aditivní. V důsledku toho se žluklá nebo kozí pachuť může projevit i v případě, že koncentrace jednotlivých kyselin nepřesahuje jejich prahovou koncentraci vnímání. Senzorické závady, které jsou důsledkem těchto kyselin, mají obvykle svůj původ ve fermentaci, kdy vzniká nadbytek těchto kyselin, než v infekci nebo surovinách (Meilgaard, 1975; Clapperton, 1978b).

Vyšší nenasycené mastné kyseliny jako jsou linolová a linoleová kyselina mají velký význam z toho hlediska, že jejich oxidativní degradací vznikají látky odpovědné za starou chuť (Dominguez a Canales, 1974; Tressl et al., 1979).

Mastné kyseliny se obvykle stanovují pomocí plynové chromatografie. Před vlastní analýzou je však nutné mastné kyseliny z piva vyextrahovat, zkoncentrovat, eventuálně ještě přečistit. K tomu je možné využít různé extrakční postupy.

Při extrakci v systému kapalina-kapalina se obvykle používá velké množství drahých a zdraví nebezpečných rozpouštědel jako je chloroform (Chen, 1980), směs chloroformu a ethanolu (Drost et al., 1971), dichlormethan (Clapperton, 1978a), a směs ethylacetátu a n-pentanu (Clarke et al., 1981). Kromě toho tento postup je časově náročný.

Klasickou extrakci v systému kapalina-kapalina nahrazuje v posledních letech stále populárnější a oblíbenější extrakce na pevné fázi (SPE). Princip spočívá v zachycení sledovaných analytů, které jsou obsaženy v kapalné fázi, na speciálním sorbentu díky silným, ale reversibilním interakcím mezi analytem a povrchem stacionární fáze. Přitom by nemělo dojít k interakcím mezi stacionární fází a složkami matrice. Mezi typické interakce patří hydrofobní van der Waalsovy síly, vodíkové můstky, síly dipól-dipól nebo iontově výměnné interakce. Sorbent je umístěn mezi fritami v extrakční minikolonce určené na jedno použití. Cílem tohoto postupu je jednak odstranění interferujících látek obsažených v matrici a jednak izolace a zakoncentrování (100x – 5000x) stanovovaných
látek.

Metoda SPE zahrnuje čtyři po sobě jdoucí kroky:

1. Kondicionace sorbentu. V této fázi se SPE kolonka připraví na interakci se sorbentem. Často se provádí methanolem, vodou nebo pufrem. Jde o nezbytný krok pro reprodukovatelnou sorpci analytů.
2. Aplikace vzorku. S využitím podtlaku vytvořeného membránovou pumpou se vzorek prosaje skrz kolonku. Sledované analyty se zachytávají v úzké zóně na sorbentu. Část interferujících látek z matrice projde kolonkou přímo do odpadu, část se adsorbuje.
3. Promytí. Zachycené interferující látky z matrice jsou odstraněny z povrchu stacionární fáze.
4. Eluce. Při tomto posledním kroku dochází k selektivní desorpci analyzovaných látek pomocí vhodného rozpouštědla (Merck, 2000; Merck, 2005).

Další technikou použitelnou ke stanovení mastných kyselin v pivu je mikroextrakce na pevné fázi – SPME. Jde o adsorpčně/desorpční techniku vyvinutou Pawliszynem v 1. polovině 90. let minulého století (Procházková, 1999; Horák et al., 2005; Horák et al., 2009a).

Další rozvoj mikroextrakčních technik dospěl k zavedení metody extrakce na míchací tyčince – SBSE. Tento postup je založen na sorpci analytů na tenký film z polydimethylsiloxanu (PDMS), kterým je pokryta míchací tyčinka (Baltusen et al., 1999). Vzhledem k podstatně většímu množství polydimethylsiloxanové fáze, do které se mohou extrahovat látky, dosahuje SBSE podstatně vyšší citlivosti než postup SPME (Bicchi et al., 2002). Využití této techniky při stanovení nižších a vyšších mastných kyselin v pivu je popsáno v pracích (Horák et al., 2008; Horák et al., 2009a; Horák et al., 2010).

Jak vyplývá z práce (Horák et al., 2009a), SPME technika je výhodná pro stanovení nižších mastných kyselin v pivu díky své jednoduchosti, reprodukovatelnosti, časové nenáročnosti a nízké ceně. Na druhé straně vlákno je velmi křehké a vyžaduje velice opatrné zacházení. Velká nevýhoda tohoto postupu spočívá v tom, že v rámci jednoho extrakčního kroku nelze stanovit jak nižší, tak vyšší mastné kyseliny. SBSE postup je v porovnání s SMPE daleko robustnější. Jde rovněž o velmi nenáročnou metodu, ale příprava extraktu tímto postupem trvá až pětkrát déle než u metody SPE. Navíc pořízení SBSE míchací tyčinky je velmi obtížné, neboť ji komerčně dodává pouze firma Gerstel. Z těchto důvodů se předložená práce zaměřuje na stanovení nižších i vyšších mastných kyselin v pivu metodou SPE.

Požadavky na dnešní analýzy zahrnují nejen získání přesných a reprodukovatelných výsledků, ale také nutnost jejich dodání v co nejkratší době. Jednou z možností, jak zkrátit celkovou dobu analytického stanovení, je urychlení plynově chromatografické separace využitím rychlejší plynové chromatografie. Toho lze dosáhnout použitím kapilárních kolon s vnitřním průměrem 0,1 mm. Nevýhoda těchto kolon spočívá v nutnosti vyvinout vysoký tlak na hlavě kolony, obvykle 600 kPa nebo ještě vyšší, dále nezbytnost rychlého ohřevu chromatografické pece a požadavky na detektory s rychle skenující elektronikou. Těmto zvýšeným nárokům nejsou všechny běžné chromatografy schopné vyhovět. Rozumným kompromisem, který umožní jak významné zkrácení plynově chromatografického stanovení, tak využití stávající instrumentace, je použití chromatografických kolon s vnitřním průměrem 0,18 mm. Pracovní podmínky na těchto tenkých kolonách lze velmi jednoduše získat “přeložením“ podmínek na stávající konveční koloně pomocí “překladového“ software (Horák et al., 2009b; Horák et al., 2009c; Snyder at al., 1992; Quimby et al., 1995).

V této práci je popsána extrakce nižších i vyšších mastných kyselin z piva pomocí SPE metody a jejich následné stanovení pomocí rychlejší plynové chromatografie. Jsou zde uvedeny pracovní charakteristiky uvedeného postupu včetně časových úspor při použití kolony o průměru 0,18 mm.

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Použité materiály, standardy

SPE kolonky LiChrolut EN 200 mg/3ml (ethylvinyl benzen divinyl benzen polymer s extrémně velkým specifickým povrchem) byly zakoupeny od fy Merck.

Volné mastné kyseliny jako kyselina isobutanová, butanová (máselná), isopentanová, pentanová (valerová), hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanové, dodekanová (laurová), tridekanová, tetradekanová (myristová), pentadekanová, hexadekanová (palmitová), heptadekanová, oktadekanová (stearová), oktadekadienová (linolová), oktadekatrienová (linolenová), oktadecenová (olejová) byly pořízeny od fy Supelco v čistotě > 99 %.

Methylestery kyselin dekanové, dodekanové, tridekanové, tetradekanové, pentadekanové, hexadekanové, heptadekanové, oktadekanové, oktadekadienové, oktadekatrienové, oktadecenové rovněž pocházely od fy Supelco, rovněž v čistotě > 99 %.

Derivatizační činidlo BF3 – methanol 14% (v/v) bylo nakoupeno od fy Fluka.

Dále byly použity kyselina chlorovodíková a rozpouštědla hexan, dichlormethan, chloroform, ethanol a methanol. Tyto chemikálie byly zakoupeny od fy Merck.

Ultračistá voda byla získána ze zařízení Millipore Milli – Q.

Plyny v tlakových lahvích – helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0, syntetický vzduch a dusík v kvalitě 4,6 dodal Messer Praha. Vakuový SPE manifold pro 12 vzorků a membránová pumpa byly nakoupeny od fy Supelco.

Chromatografická kolona DB-WAX o délce 10 m, vnitřním průměru 0,180 mm a tloušťce filmu 0,18 μm byla pořízena od fy Agilent J&W.

Vzorky piva plzeňského typu vyrobené v ČR pocházely z obchodní sítě.

2.2 Metoda

2.2.1 SPE extrakce

Postup extrakce mastných kyselin z piva vycházel z práce Hage, 1987, kdy pomocí SPE metody jsou volné mastné kyseliny vyextrahovány z piva. Nižší mastné kyseliny jsou přímo stanoveny na plynovém chromatografu. Vyšší mastné kyseliny se derivatizací převedou na příslušné methylestery.

SPE kolonky byly nejprve kondicionovány 2,5 ml methanolu a následně promyty 5,0 ml vody. Poté bylo kolonkou za pomoci vakua vytvořeného membránovou vývěvou prosáto 20 ml odpěněného vzorku piva, které bylo okyseleno 1,0 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové a obohaceno přídavkem 10 μl ethanolového roztoku vnitřních standardů (heptanová kyselina, pentadekanová kyselina ve výsledné koncentraci 1,3 mg/l piva). K odstranění interferencí byla v dalším kroku kolonka promyta 5,0 ml ultračisté vody. Potom byla kolonka vysušena pod mírným proudem dusíku. Nakonec byly mastné kyseliny eluovány pomocí chloroformu – 2 x 0,5 ml – oba podíly byly spojeny a celkový extrakt byl následně analyzován.

Pro stanovení nižších mastných kyselin (C4 – C10) byly 2 μl tohoto chloroformového extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu.

Ke stanovení vyšších mastných kyselin (C12 – C18) bylo nutné chloroformový extrakt odpařit pod jemným proudem dusíku a provést methylaci vyšších mastných kyselin přídavkem 0,1 ml derivatizačního činidla BF3 – methanol 14% (v/v). Derivatizace probíhala po dobu 20 min při teplotě 95 °C. Reakce je zastavena přidáním 0,2 ml vody a důkladným protřepáním. Poté se v ultrazvukové lázni methylestery vyšších mastných kyselin vyextrahují do 0,2 ml hexanu. Extrakce se provádí po dobu 2 min.

2.2.2 GC analýza

Stanovení jak nižších, tak vyšších mastných kyselin bylo provedeno za stejných podmínek na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001 vybaveného split/spiltless injektorem a plamenoionizačním detektorem (FID). Plynový chromatograf byl vybaven automatickým dávkovačem vzorků Labio ASG 40 od fy Labio.

Chromatografická kolona byla vytemperována na počáteční teplotu 120 °C a po nástřiku vzorku byla tato teplota udržována po dobu 0,7 min. Následoval teplotní gradient 30 °C/min až do teploty 200 °C a při této teplotě byla kolona ponechána po dobu 6 min. Nástřik byl prováděn v režimu split, dělící poměr byl 1:10. Teplota injektoru i detektoru byla shodná, 220 °C. Jako nosný plyn bylo použito helium v kvalitě 5.0 a tlak na hlavu kolony byl nastaven na 200 kPa při teplotě 120 °C.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

V rámci validace metody byla ověřována linearita, výtěžnost a opakovatelnost metody SPE. Za tímto účelem byly připraveny standardní roztoky sledovaných analytů v 5% (v/v) roztoku ethanolu. Výsledky jsou uvedeny v tab. 1.

Kalibrační křivky byly proměřeny v rozsahu od 0,0015 až 8 mg/l, který pokrývá obvyklé koncentrace volných mastných kyselin v pivu plzeňského typu. Jak vyplývá z tab. 1, korelační koeficienty pro všechny stanovované látky při použití lineární regrese ležely v rozmezí 0,9971 až 0,9999. V daném koncentračním rozsahu se metoda vyznačuje vysokou linearitou.

Správnost metody byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v pěti reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Výtěžnost nižších mastných kyselin se pohybovala v rozmezí 96–107 %, s průměrnou hodnotou 100 %. Výtěžnost vyšších mastných kyselin byla 95–115 %, s průměrnou hodnotou 105 %. Výborné hodnoty výtěžnosti pro všechny stanovované analyty potvrzují vysokou účinnost a tedy vhodnost použití daného typu SPE kolonky.

Opakovatelnost metod byla zjištěna pětinásobným opakováním celého postupu během jednoho dne na jednom a témž vzorku piva. Z výsledků uvedených v tab. 1 je patrné, že pro nižší mastné kyseliny se hodnota relativní směrodatné odchylky (RSD) nachází v intervalu 5,8 až 8,3 %, s průměrnou hodnotou 7,1 %. Pro vyšší mastné kyseliny nabývá RSD hodnot 11 až 16 %, v průměru 12,8 %. Z výsledků je zřejmé, že vyšší mastné kyseliny mají horší hodnoty opakovatelnosti než nižší mastné kyseliny, což zřejmě souvisí s dalšími kroky v rámci přípravy vzorku – derivatizace za účelem získání příslušných methyl esterů a jejich následné extrakci do hexanu. Oba tyto kroky podle očekávání přispívají ke zhoršení hodnot opakovatelnosti. Na druhé straně i tyto hodnoty jsou plně akceptovatelné.

Tab. 1 Pracovní charakteristiky metody SPE při stanovení mastných kyselin v pivu. r – korelační koeficient při použití lineární regrese

Při ověřování vhodnosti použití tenké kolony o vnitřním průměru 0,18 mm byla pozornost zaměřena na opakovatelnost retenčních časů. Pro kvantitativní analýzu je také podstatné, aby zůstával konstantní poměr jednotlivých látek při opakované analýze téhož vzorku. Za tímto účelem bylo provedeno sedmkrát opakované měření stejného vzorku. V tab. 2 jsou uvedeny relativní směrodatné odchylky retenčních časů a relativní směrodatné odchylky relativní plochy (vzhledem k celkové ploše integrovaných píků) chromatografických píků. Z výsledků vyplývá, že reprodukovatelnost, vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka, retenčních časů je lepší než 0,11 %. Relativní směrodatná odchylka pro plochu stanovovaných látek vykazuje hodnoty lepší než 6,4 %.

Tab. 2 Relativní směrodatná odchylka retenčních časů (RSD tr) a relativní směrodatná odchylka relativních ploch (RSD A) mastných kyselin na koloně DB WAX 10 m, 0,18 mm I.D., 0,18 μ

4 ZÁVĚR

Předložená práce ukázala, že použití SPE metody s využitím kolonek LiChrolut EN 200 mg/3 ml je vhodné k rutinní analýze mastných kyselin v pivu (opakovatelnost pro všechny stanovované látky je lepší než 16 %). Použití kapilární kolony o vnitřním průměru 0,18 mm umožňuje zkrátit dobu vlastního stanovení pod 4 min, a tak zvýšit jak kapacitu laboratoře, tak využití stávajících plynových chromatografů.