Stanovení izomerů nižších mastných kyselin, senzoricky aktivních produktů stárnutí chmele, v pivu

K významným produktům stárnutí chmele se řadí C4 a C5 izomery nižších mastných kyselin, kyselina 2-methylpropanová (isomáselná), 2-methylbutanová a 3-methylbutanová (kyselina isovalerová). Výše zmíněné kyseliny jsou samy o sobě nejen senzoricky aktivní, ale v procesu výroby piva mohou poskytovat po esterifikaci i další senzoricky významné produkty přispívající k pachuti piva po stárnutí. V rámci této studie byla vypracována dostatečně citlivá a selektivní metoda stanovení obsahu těchto látek v pivu, založená na izolaci nižších mastných kyselin a jejich izomerů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a kvantitativním vyhodnocení pomocí kapilární plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS). Detekce pomocí hmotnostního spektrometru odstranila problémy spojené s obtížným chromatografickým dělením výše zmíněných isomerů a jejich kvantifikací. Podařilo se tak zpřesnit výsledky kvantitativní analýzy vzorků v porovnání s detekcí pomocí klasického plamenoionizačního detektoru (FID). Optimalizovaná metoda byla následně využita při sledování změn obsahu nižších mastných kyselin a jejich izomerů v pivu vyrobeném ze starého a čerstvého chmele a při použití infuzního a dekokčního varního postupu.

1 Úvod

Stárnutí chmele je provázeno mnoha změnami, zejména změnami oxidačními. Výsledkem je odštěpení postranních řetězců hořkých kyselin, tak jak je to znázorněno na obr. 1. Mechanismus vzniku navrhli Howard a Tatchell v roce 1956 na základě získaných výsledků působení peroxidu vodíku na α- a β- hořké kyseliny. Sandra a Verzele (1975) prezentovali výsledky, že chmelená piva obsahovala v porovnání s pivy nechmelenými vyšší množství výše zmíněných isomerů C4 a C5 mastných kyselin. Autoři předpokládali, že tyto látky vznikly jako vedlejší produkty oxidace během skladování chmele a při chmelovaru. Hashimoto a Eshima (1977) uvádějí, že kromě výše zmíněných skutečností se mohou takto vzniklé nižší mastné kyseliny dále podílet na vzniku jejich senzoricky aktivních aldehydů, spoluodpovědných za starou chuť piva. Tyto látky se mohou dostat až do hotového piva, přičemž k jejich zvýšenému obsahu (zvláště u isovalerové kyseliny) může za nepříznivých okolností rovněž přispívat činnost kvasinek při kvašení.

Obr. 1 Předpokládaný mechanismus oxidačního štěpení α- a β-hořkých kyselin

Izomery kyselin propanové a butanové se vyznačují význačným „sýrovým“ aroma (Krüger, Anger, 1996; Peacock, 1998). U izomáselné kyseliny uvádějí prahovou hodnotu vnímaní v pivu 30 mg/kg a u isovalerové kyseliny 1,5 mg/kg. Naproti tomu jiní autoři (Hanke et al. 2010) uvádějí prahovou hodnotu vnímání u isovalerové kyseliny pouhých 0,325 mg/l. Současně však zjistili, že byl negativní senzorický vjem u isovalerové kyseliny potlačen zvýšeným obsahem ethyl- a isoamylacetátu.

Cílem práce bylo vypracovat vhodnou izolační metodu a navrhnout selektivní analytický postup pro kvalitativní i kvantitativní stanovení diskutovaných látek. S ohledem na jejich stopová množství v pivu bylo navrženo využít k detekci a stanovení těchto látek přístrojové spojení kapilárního plynového chromatografu a hmotnostního detektoru (GC-MS). Jelikož se jednotlivé izomery špatně chromatograficky dělí, byla pro kvantitativní a kvalitativní analýzu použita technika SIM (selected ion monitoring), při které je z fragmentačního spektra látky vybrán pro vyhodnocení charakteristický iont.

Výsledky nově navržené metody byly srovnány s výsledky celkové analýzy mastných kyselin pomocí spojení kapilárního plynového chromatografu s plamenoionizačním detektorem (GC-FID) (Horák et al., 2005 a 2009), která však neumožňuje dokonalé kvalitativní i kvantitativní vyhodnocení obsahu isomerů 2- a 3-methylbutanové kyseliny.

V závěru byla navržená metoda využita při studiu vlivu stáří použitého chmele na obsah isomerů nižších mastných kyselin v pivu a dále při porovnání vlivu infuzního a dekokčního varního postupu na obsah nižších mastných kyselin a jejich isomerů v pivu.

2 Experimentální část

Kyseliny 2-methylpropanová (isomáselná), butanová (máselná), 2-methylbutanová, 3-methylbutanová (isovalerová), pentanová (valerová), hexanová (kapronová), heptanová (interní standard), oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová) a dekanová (kaprinová), byly ze vzorku extrahovány metodou extrakce na pevné fázi (SPE) a následně stanoveny pomocí GC-MS.

Příprava vzorku pro SPE byla provedena následujícím způsobem. K 20 ml odplyněného vzorku piva bylo přidáno 10 μl pracovního roztoku vnitřního standardu heptanové kyseliny o koncentraci 2 g/l a 1 ml 1 M HCl.

Extrakce na pevné fázi byla prováděna na SPE kolonkách LiChrolut EN 200 mg (Merck). Kolonka byla kondicionována postupným přídavkem 2,5 ml methanolu a následně 5,0 ml vody. Poté byl na kolonku, aniž by kolonka vyschla, nanesen vzorek a zvolna pomocí vakua extrahován. Eluce sorbovaných nižších mastných kyselin byla následně provedena dvojnásobným přídavkem 0,5 ml chloroformu. Extrakt byl přenesen do 2 ml vialek opatřených inzertem a analyzován pomocí GC-MS.

Stanovení nižších mastných kyselin a jejich C4 a C5 izomerů bylo provedeno pomocí přístrojového spojení kapilárního plynového chromatografu Trace a kvadrupólového hmotnostního spektrometru DSQ II (Thermo Fisher).

Analýza probíhala na křemenné kapilární koloně Tr WaxMS o délce 30 m, vnitřním průměru 0,25 mm a tloušťce fáze 0,25 μm za následujících podmínek: teplotní program: 60 °C (2 min) – 5 °C/min – 200 °C – 40 °C/min – 220 °C (2 min), teplota injektoru 220 °C, nástřik 50 s splitless, objem nástřiku 1 μl. Průtok nosného plynu He činil 1,2 ml/min.

Teplota propojení s hmotnostním spektrometrem činila 250 °C. U C4 a C5 izomerů mastných kyselin a interního standardu (kyseliny heptanové) byl obsah analytů stanoven pomocí módu SIM (vybraných iontů), u zbývajících mastných kyselin pomocí celkového iontového toku (TIC).

Metoda byla využita při analýze piv získaných ze série pokusných čtvrtprovozních várek, kde byly sledovány změny obsahu isomerů nižších mastných kyselin při aplikaci čerstvého a staršího chmele a při porovnání vlivu infuzního a dekokčního varního postupu. Kvašení probíhalo za standardních podmínek s použitím stejného kmene kvasinek tak, aby bylo vyloučeno ovlivnění výsledků podmínkami fermentace. Použity byly vzorky starších chmelů: Premiant (sklizeň 2009), Bor a Sládek (sklizeň 2009), Žatecký poloraný červeňák (sklizeň 2009) a čerstvý Žatecký poloraný červeňák (sklizeň 2011).

3 Výsledky A Diskuse

Jak vyplývá z obr. 2, při použití běžné 30 metrové kapilární kolony o tloušťce filmu 0,25 μm, kdy se retenční časy obou látek od sebe liší o pouhé setiny minuty (na obr. 2 označeno b) a c)), nelze dosáhnout dokonalé separace píků 2- a 3-methylbutanové kyseliny. Zlepšení rozlišení by bylo možno dosáhnout použitím delší, např. 60 m kolony, ale vedlo by to k neúměrnému prodloužení doby analýzy. V případě MS detekce v SIM módu lze tento problém eliminovat správným výběrem iontů použitých pro vyhodnocení. Tímto způsobem lze kvantifikovat požadované analyty i v případě horšího chromatografického rozlišení (viz obr. 2). Detekce pomocí FID nám tuto možnost nenabízí.

Obr. 2 Chromatogram nižších mastných kyselin a jejich C4 a C5 isomerů (GC-MS)

Na základě porovnání výsledků získaných pomocí detektorů FID a MS (tab. 1) lze konstatovat, že bylo mezi srovnávanými metodami u všech nižších mastných kyselin, s výjimkou stanoveného obsahu C4 a C5 kyselin a jejich izomerů a dále kyseliny kaprinové, dosaženo velmi dobré shody. Zřejmě falešně pozitivní zvýšený obsah kyseliny kaprinové, stanovený pomocí detektoru FID, byl s nejvyšší pravděpodobností způsoben koelucí sloučeniny s totožným retenčním časem. V těchto případech se projevuje výhoda použití vysoce specifického a citlivého MS detektoru v porovnání s klasickým nespecifickým FID detektorem.

Tab.1 Porovnání hodnot obsahu nižších mastných kyselin v pivu získaných pomocí GC-FID a GC-MS

Výsledky pokusných várek se starým a čerstvým chmelem (obr. 3) potvrdily předpoklad, že přítomnost oxidačních produktů hořkých kyselin ve starších vzorcích chmele vede k mírnému zvýšení obsahu C4 a C5 izomerů nižších mastných kyselin v pivu. V případě isovalerové kyseliny se blížil prahové hodnotě senzorického vnímání. Lze proto předpokládat, že zvýšený obsah těchto látek nebude přímo odpovědný za starou chuť vyrobeného piva, ale bude pouze jedním z příspěvků k výslednému celkovému senzorickému vjemu.

Obr. 3 Porovnání obsahu C4 a C5 izomerů mastných kyselin ve vzorcích piv vyrobených ze starého a čerstvého chmele

Vliv rozdílného použitého varního postupu (infuze-dekokce) na změny obsahu C4 a C5 izomerů i ostatních nižších mastných kyselin nebyl na základě získaných dat potvrzen (obr. 4). Bylo však pozorováno značné kolísání obsahu analytů u jednotlivých dvojic várek. Lze to vysvětlit možnými odchylkami průběhu jednotlivých chmelovarů. Hlubší závěry však zatím nelze, s ohledem na omezený počet varních zkoušek a na základě zatím nedostatečného množství získaných výsledků, vyvodit.

Obr. 4 Vliv zvoleného varního postupu na obsah nižších mastných kyselin a jejich izomerů v pivu

Pozn.: Piva č. 1,2,5 a 6 a obdobně piva 3,4,7 a 8 byla vyrobena ze dvou rozdílných sladů. Piva 1,2,3 a 4 byla vyrobena v první sérii zkoušek, piva 5,6,7 a 8 ve druhé sérii zkoušek.

V obou případech poskytla nově navržená GC-MS metoda stanovení C4 a C5 -izomerů i ostatních nižších mastných kyselin spolehlivé výsledky.

4 Závěr

Byla vypracována dostatečně citlivá a selektivní metoda stanovení obsahu C4 a C5 izomerů i ostatních nižších mastných kyselin v pivu, založená na jejich izolaci pomocí SPE a kvantitativním vyhodnocení pomocí GC-MS. Současně byla zjištěna shoda mezi výsledky získanými metodou GC-FID a GC-MS. Na rozdíl od dříve používané metody GC-FID však metoda GC-MS pracující v SIM módu vyniká vyšší citlivostí a specifičností a navíc umožňuje kvantitativně vyhodnotit obsah C4 a C5 izomerů nižších mastných kyselin i v případě jejich nedokonalého chromatografického rozdělení.

Použití staršího chmele vedlo u piva z pokusných várek k mírnému nárůstu obsahu oxidačních produktů hořkých kyselin, C4 a C5 izomerů nižších mastných kyselin.