Přihlášení
Registrace
Nastavení
Filtrování
Filtrování
Obnova hesla
Obnova hesla
Agilent 7010 GC/MS/MS trojitý kvadrupól v analýze environmentálních kontaminantů
Út, 19.5.2020
| Originální článek z: HPST/Trojitý (triple) kvadrupól (QQQ)
Komplexní výsledky reálného demo měření aplikačních specialistů HPST pro 41 enviro kontaminantů a vzorků povrchových vod pomocí GC/QQQ Agilent 7010 series.

HPST: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

V rámci uskutečněného měření byla provedena analýza 41 environmentálních kontaminantů v rozpouštědlových standardech na deseti koncentračních hladinách a ve vzorku povrchové vody (přirozené/uměle kontaminované). Všechna měření byla provedena s využitím plynového chromatografu Agilent 7890/8890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitý kvadrupól Agilent 7010 MS/MS. Cílem experimentů bylo stanovit limity detekce pro jednotlivé sloučeniny ve standardech rozpouštědel a připravených extraktech povrchové vody a určit opakovatelnost (RSD, %) a linearitu GC/MS/MS měření v módu elektronové ionizace (EI).

Cílové analyty

Seznam cílových analytů

Měřené vzorky

  • Směsný standard všech výše uvedených látek o koncentraci 100 ng/ml isooktanu. Standard o koncentraci 100 ng/ml byl následně použit pro přípravu série kalibračních roztoků o koncentraci 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 a 0.005 ng/ml. Kalibrační roztoky byly naředěny do čistého isooktanu.

  • Vzorek povrchové vody (přirozeně kontaminovaný). Vzorek povrchové vody byl následně uměle kontaminován výše uvedeným standardem na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

Instrumentální vybavení – základní informace

Agilent 7010 GC/MS/MS představuje čtvrtou generaci trojitých kvadrupólů (QQQ) společnost Agilent Technologies, který je v kombinaci s plynovým chromatografem (GC) Agilent 7890B/8890 ideálním řešením pro účely vysoce selektivní ultra-stopové kvantitativní analýzy v komplexních matricích. Velmi nízké limity detekce dosažitelné pomocí nového QQQ potvrzuje i deklarovaný detekční limit přístroje (IDL, Instrument Detection Limit) 0,5 fg OFN, jehož dosažení je požadováno při instalaci přístroje a během jeho životnosti. Agilent 7010 GC/MS/MS využívá efektivní ionizaci neutrálních molekul v iontovém zdroji, které jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu, fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele a detekovány v triple-off-axis detektoru.

Obrázek 1-2: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

Plynový chromatograf 7890B/8890 GC přináší vysoce účinnou chromatografickou separaci. Inertní cesta od nástřiku po detektor využívá chemicky deaktivované technologie a spotřební materiál a napomáhá tak dosažení ještě lepší citlivosti vlastní analýzy. Nástřik vzorků je možný prostřednictvím různých typů inletu, jako je split/splitless, PTV či Multi Mode Inlet (MMI), který v sobě kombinuje výhody obou dvou předcházejících typů nástřiku. Turn Top systém těsnění inletů umožňuje výměnu linerů během 30 s bez nutnosti jakýchkoliv nástrojů. Přesná kontrola tlaků/průtoků plynu je umožněna díky použité kapilární fluidní technologii (CFT), která kromě velmi dobré opakovatelnosti výsledků přináší také možnost využití tzv. zpětného toku (backflush), dean switching nebo dělení toku do několika paralelně zapojených detektorů. Zpětný tok (backflush) podporovaný CFT zkracuje dobu analýzy, prodlužuje životnost GC kolony, snižuje riziko carry-over efektu a výrazně snižuje potřebu údržby iontového zdroje, kterou lze doplnit také automatickým čištěním pomocí technologie SCIS (aktivní čištění vodíkem – více detailů v prvním čísle časopisu). V souvislosti s přesnou kontrolou průtoku mobilní fáze lze také implementovat tzv. retention time locking (RTL), který umožňuje dosažení identických retenčních časů nezávisle na operátorovi či údržbě kolony, což výrazně urychluje vlastní analýzu, a to především v případě multireziduálních metod.

Ionty vzniklé v iontovém zdroji jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu s rozsahem hmot až do 1050 amu. Stabilita monolitického kvadrupólu umožňuje zahřívání až na 200 °C, čímž dochází k tepelnému čištění a odstraňování kontaminace běžné u kovových kvadrupólů.

V režimu MS/MS jsou ionty vybrané v prvním kvadrupólu následně fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele pomocí dusíku jako kolizního plynu. Do cely je také přiváděno malé množství tzv. zhášecího plynu (quenching gas), který snižuje množství přítomných metastabilních částic hélia (v případě, že je helium použito jako mobilní fáze). Tyto metastabilní částice navyšují neutrální šum detektoru, který je použitím zhášecího plynu eliminován.

Obrázek 3-5: Multi mode inlet (MMI) - Vyhřívaný zlatý hyperbolický kvadrupól - Triple-axis detektor

K detekci vybraných hmotnostních přechodů či iontů (v případě použití trojitého kvadrupólu jako jednoduchého kvadrupólu) dochází v tzv. triple-axis detektoru. Umístění elektronásobiče dvojitě mimo osu vzhledem ke vstupu iontů do detektoru vede ke snížení šumu a následně i detekčních limitů přístroje.

Software

Ovládání přístroje i následné zpracování dat je kontrolováno pomocí unikátního softwaru MassHunter. MassHunter akviziční software umožňuje měření ve vybraných módech MRM (multiple reaction monitoring), SIM (selected ion monitoring), full scan, scan produktových iontů atd. V rámci MRM měření je možno snímat až 800 MRM přechodů za sekundu s minimálním dwell time 0,5 ms a nulovým cross talk efektem. Ladění a kalibrace přístroje probíhá plně automaticky. Pro rychlé a efektivní zavedení nových MS metod či nových analytů do stávajících metod je možné využít rozsáhlou databázi MRM přechodů pesticidů a environmentálních kontaminantů.

Mass Hunter Quantitative Analysis pro kvantitativní zpracování dat umožňuje tzv. „Batch-at-a-Glance“ náhled na data. Vyhodnocovací metoda je pak tvořena z velké části automaticky na základě informací zadaných v akviziční metodě (MRM přechody pro jednotlivé sloučeniny, názvy sloučenin, retenční čas, typ analytu — vnitřní standard, cílový analyt) a vlastní sekvenci (typ vzorku — kalibrační roztok, vzorek, blank atd.). Reportování výsledků je možno provádět do Excelu nebo je k dispozici velké množství předpřipravených reportů v různých formátech. V případě potřeby je možno formát reportu upravit na míru.

Kvalitativní zpracování dat probíhá v MassHunter Qualitative Analysis. V této části softwaru je možno využívat při měření v MRM módu např. funkci Find Compounds by MRM pro kontrolu retenčních časů, manuální integraci, porovnávání vzorků mezi sebou atd. V případě měření ve full scan módu je možné na základě naměřených spekter provádět např. identifikaci látek ve spojení s vybranou knihovnou spekter (NIST apod.). Z naměřených dat je pak možná i tvorba vlastních knihoven.

Experimentální část

Všechny GC/MS/MS experimenty byly provedeny na plynovém chromatografu Agilent 7890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem Agilent 7010 typu trojitý kvadrupól. Plynový chromatograf byl vybaven autosamplerem Agilent 7693A, multimode inletem (MMI), purge ultimate jednotkou (PUU), která umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a modulem pro pneumatickou kontrolu (pneumatics control modul, PCM). Pro separaci byly využity dvě HP-5 MS UI kapilární kolony (15 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm tloušťka filmu) zapojené za sebou v tzv. mid-column backflush uspořádání. Schématické znázornění celého systému je uvedeno na Obrázku 6.

Obrázek 6 Schématické znázornění systému Purge ultimate union (PUU), který umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a no-vent aplikaci.

Optimalizace GC/MS/MS metody

Pro stanovení všech výše uvedených kontaminantů byla zvolena metoda předdefinovaná v databázi MRM přechodů dodávaná firmou Agilent Technologies. V rámci této databáze jsou kromě MRM přechodů a kolizních energií pro jednotlivé sloučeniny také stanoveny přesné retenční časy. Pro zavedení GC metody byl nejprve proveden tzv. Retention Time Locking s využitím chlorpyrifos-ethylu jako lockovací sloučeniny. V dalším kroku byly z MRM databáze vybrány pro cílové analyty příslušné MRM přechody (3 MRM přechody/1 sloučenina), které byly následně dle zadaných kritérií automaticky rozděleny do jednotlivých časových segmentů, a to s využitím nástroje „Compound List Assistent“. Pro sloučeniny, které nejsou uvedeny v MRM databázi, byly přechody naladěny s využitím dodaného standardu. Na závěr byla provedena optimalizace podmínek nástřiků, byly otestovány módy nástřiku cold splitless (CLS, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). V Tabulce I je uveden přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů.

Tabulka I: Přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů

Parametry GC/MS/MS metody

Parametry GC/MS/MS metody

Sekvence

V rámci experimentu byly změřeny níže uvedené sekvence standardu a vzorku. Pro výpočet opakovatelnosti byly dané standardy a vzorky změřeny 10× za sebou. Na začátku každé sekvence byl proveden nástřik čistého isooktanu pro kontrolu kontaminace pozadí.

Sekvence měření

Výsledky a diskuze

GC/MS/MS metoda

Jak bylo zmíněno výše, většina parametrů GC metody byla převzata z Agilent MRM database přechodů pro pesticidy a environmentální kontaminanty. Tato metoda byla již dříve otestovaná pro analýzu pesticidů a poskytuje velmi dobré chromatografické rozlišení i pro některé standardně koeluující se izomerické sloučeniny, které není možné rozdělit na základě rozdílných MRM přechodů. Větší pozornost byla věnována optimalizaci podmínek nástřiku.

V rámci experimentů byly otestovány různé typy (CSL, HSL, SV) a objemy nástřiku (1 a 2 μl), a to z hlediska tvaru píku, opakovatelnosti nástřiku a dosažených detekčních limitů přístroje (IDL). Z hlediska tvaru píku byly dosaženy dobré výsledky při použití všech typů nástřiků. Ukázky tvaru píku při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny na obrázku v Příloze 1 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz). Opakovatelnost a IDL jsou podrobněji diskutovány níže.

V rámci metody byl využit již dříve zmíněný zpětný proplach kolony, tzv. backflush, který zvyšuje robustnost a dlouhodobou stabilitu celého systému. Zpětný proplach kolony chrání zdroj před méně těkavými složkami vzorku, které jsou ze systému eliminovány přes ventovací kapiláru. Na Obrázku 9 je ukázáno srovnání stability signálu a základní linie při GC/MS/MS měření s/bez zapojení zpětného proplachu kolony.

Obrázek 9: Srovnání stability signálu GC/MS/MS měření (A) bez a (B) s využitím zpětného proplachu kolony.

S ohledem na to, že různé matrice obsahují rozdílné matriční koextrakty, které mohou následně rušit GC/MS/MS analýzu, je v rámci Agilent MRM databáze pro každou sloučeninu dostupných pět a více MRM přechodů tak, aby pro každou matrici bylo možné vybrat MRM přechody bez případných interferencí.

Opakovatelnost

Na základě dat získaných z měření byla stanovená opakovatelnost analýz vyjádřena jako relativní směrodatná odchylka (RSD, %) z deseti po sobě jdoucích nástřiků daného standardu. Detailní přehled vypočtených hodnot je uveden v Tabulce II a III.

Opakovatelnost v závislosti na objemu nástřiku

V Tabulce II je vypočtena opakovatelnost měření při nástřiku 1 μL standardu o koncentraci 10, 1 a 0.1 ng/ml v módu cold splitless (CSL). Z výsledků je patrné, že pro většinu sloučenin byla opakovatelnost na všech třech koncentračních hladinách nižší než 15 %. Na hladině 10, 1 a 0.1 ng/ml se opakovatelnost pohybovala v intervalu 2.8-8.3 %, 5.1-18.8 % a 3.3-16.5 % v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce II označeny červeně) byly dosaženy především na nejnižší testované koncentrační hladině 0.1 ng/ml. Pro látky, které nebylo možné za standardních podmínek na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka II: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při nástřiku 1 μl v modu cold splitless; n = 10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině za standardních podmínek detekovat.

V Tabulce III je uvedeno porovnání opakovatelnosti měření standardu 0.1 ng/ml dosažených při použití různých typů nástřiků – cold splitless (CSL, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). Opakovatelnost se pohybovala v intervalu 2.2-16.5 %, 4.9-15.6 %, 5.3-23.0 % a 2.6-19.8 % při použití CSL 1 μl, CSL 2 μl, HSL 1 μl a SV 2 μl v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce III označeny červeně) byly dosazeny především u sloučenin s vyšším detekčním limitem, tj. hladina 0.1 ng/ml byla velmi blízko jejich detekčního limitu. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka III: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření standardu 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Detekční limit přístroje (IDL)

Detekční limit přístroje (IDL) byl pro všechny analyty vypočten na základě osmi opakování nástřiku standardu 0.1 ng/ml. Výpočet IDL byl proveden s využitím softwaru MassHunter na základě standardního statistického zhodnocení naměřených dat dle vzorce uvedeného níže.

Výpočet detekčního limitu přístroje (IDL)

  • IDL je detekční limit přístroje
  • T je “t” hodnota Studentova rozdělení pro 99% interval spolehlivosti a n-1 stupňů volnosti
  • % RSD je relativní směrodatná odchylka z n opakování

Vypočtené detekční limity přístroje na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny v Tabulce IV. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A a jejich výpočet IDL byl proveden na základě měření standardu o koncentraci 1 ng/ml (viz Tabulka IV – sloupec s označením 1 ng/ml CSL 1 μl). Z výsledků je patrné, ze nejnižší IDL byl pro většinu sloučenin dosažen při použití nástřiku 1 μl v módu cold splitless. Při použití tohoto typu nástřiku se IDL pro všechny detekované sloučeniny pohyboval v intervalu 0.001-0.109 ng/ml. Nástřik 1 μl v cold splitless módu byl dále použit pro analýzu reálného vzorku potoční vody.

Tabulka IV: Přehled vypočtených IDL (ng/ml) na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Lineární dynamický rozsah

Linearita měření byla vyjádřena jako regresní koeficient (R2) vypočtený pro kalibrační křivku v oblasti od nejnižšího kalibračního bodu do 100 ng/ml. Pro všechny analyty se regresní koeficient pohyboval v intervalu 0.9965 - 0.9999. Ukázka kalibrační křivky pro hexachlorbenzen je uvedena na Obrázku 11. Ukázky chromatogramu nejnižších kalibračních bodů pro jednotlivé sloučeniny jsou uvedeny na obrázku v Příloze 3 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Obrázek 11: Ukázka kalibrační křivky – hexachlorbenzen, 0.005-100 ng/ml, 10 bodů, R2 = 0.9997

Měření vzorků potoční vody – opakovatelnost

Na základě předchozích měření roztoku standardu 0.1 ng/ml byl pro závěrečné měření reálného vzorku potoční vody vybrán nástřik o objemu 1 μl v módu cold splitless. V rámci měření reálných vzorků byl každý vzorek změřen desetkrát. Nejprve byl změřen přirozeně kontaminovaný vzorek potoční vody, který byl následně uměle kontaminován na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

U reálně kontaminovaného vzorku 5 se opakovatelnost (RSD, %) u detekovaných sloučenin pohybovala v intervalu 5.9-23.9%. Relativně vysokých RSD (%) bylo dosaženo z důvodu velmi nízkých koncentračních hladin, na kterých byl vzorek kontaminován, tj. zjištěné koncentrace byly velmi blízko detekčního limitu. Stejný trend lze pak sledovat i u uměle kontaminovaných vzorků. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce V označeny červeně) byly dosaženy především u sloučenin s vyššími detekčními limity. Pro látky, které nebylo možné v daném vzorku detekovat, je v tabulce uvedeno N/A. Ukázky chromatogramů reálně a uměle kontaminovaného vzorku potoční vody jsou uvedeny v Příloze 2 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Tabulka V: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření reálně (Vzorek 5) a uměle kontaminovaného vzorku (SP1, SP2, SP3) potoční vody při nástřiků 1 μl v módu cold splitless; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné v daném vzorku detekovat.

Závěr

Na základě výsledků získaných základním testováním výkonu nového GC/MS/MS systému Agilent Technologies 7010 Series lze reálně zhodnotit skutečné detekční limity pro vybrané analyty na základě získaných % RSD, které jsou, společně se skutečnými chromatografickými záznamy, nejvhodnějším způsobem objektivního zhodnocení reálných možností stroje. Konfigurace stroje využívající technologie pro vysokou robustnost a dlouhodobou stabilitu jako např. CFT - backflush modul ukazují, že tyto prvky patří k neoddělitelným součástem konfigurací především u instrumentů určených pro ultrastopovou analýzu ve složitých matricích.

Multimode/PTV injektor dále umožňuje v případě potřeby ještě výrazněji posunout detekční limity nástřikem většího objemu vzorku, a to běžně 4 – 8 nebo i 25 a více mikrolitrů v závislosti na typu matrice a potřebných detekčních limitech.

Výhodou vysoké citlivosti modelu 7010 Series a tedy možnosti nastřikovat menší objemy vzorků (především těch s komplikovanou matricí) přináší výrazně nižší kontaminaci systému, delší životnost spotřebního materiálu (linery, kolony), což snižuje celkové provozní náklady a výrazně snižuje také potřebu údržby a čištění především iontového zdroje samotného MS/MS detektoru.

V případě minimalizace manuální údržby celého systému a potřeby udržení maximálního výkonu MS/MS detektoru lze systém vybavit technologií SCIS (Self Cleaning Ion Source), která využívá reaktivity vodíku přidávaného do iontového zdroje ve velice malých množstvích, čímž udržuje iontový zdroj kontinuálně čistý, nebo aktivně v potřebných intervalech iontový zdroj čistí nezávisle na samotných analýzách.

HPST
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluation of Ultra High Resolution Mass Spectrometer in Targeted Forensic Screening Method for Urine Analysis in Comparison to Immunoassay and GC-MS Techniques

Postery
| N/A | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie, Klinická analýza

Mass Spectrometry Applications for Environmental Analysis

Příručky
| 2014 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, Příprava vzorků, GC/SQ, GC/QQQ, HPLC, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap, LC/QQQ, IC-MS, IC/MS/MS, LC-SQ, LC/IT
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

Food Safety Applications NotebookEnvironmental Contaminants - Environmental Contaminants

Příručky
| 2012 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC, Příprava vzorků, Spotřební materiál, Iontová chromatografie, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies, Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

STANOVENÍ AROMATICKÝCH ALKOHOLŮ V PIVU S VYUŽITÍM METODY EXTRAKCE NA PEVNÉ FÁZI (SPE) A DETEKCE POMOCÍ SPOJENÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (GC-MS) Část I. – Vypracování a validace vhodné analytické metody

V úvodní části jsou krátce shrnuty poznatky týkající se analytických postupů stanovení aromatických alkoholů a doplněny o stručnou literární rešerši věnovanou jejich vzniku, úloze a senzorickým účinkům v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení izomerů nižších mastných kyselin, senzoricky aktivních produktů stárnutí chmele, v pivu

Citlivá metoda založená na izolaci nižších mastných kyselin a jejich izomerů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a kvantitativním vyhodnocení pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS).
Agilent 7010 GC/MS/MS trojitý kvadrupól v analýze environmentálních kontaminantů
Út, 19.5.2020
| Originální článek z: HPST/Trojitý (triple) kvadrupól (QQQ)
Komplexní výsledky reálného demo měření aplikačních specialistů HPST pro 41 enviro kontaminantů a vzorků povrchových vod pomocí GC/QQQ Agilent 7010 series.

HPST: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

V rámci uskutečněného měření byla provedena analýza 41 environmentálních kontaminantů v rozpouštědlových standardech na deseti koncentračních hladinách a ve vzorku povrchové vody (přirozené/uměle kontaminované). Všechna měření byla provedena s využitím plynového chromatografu Agilent 7890/8890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitý kvadrupól Agilent 7010 MS/MS. Cílem experimentů bylo stanovit limity detekce pro jednotlivé sloučeniny ve standardech rozpouštědel a připravených extraktech povrchové vody a určit opakovatelnost (RSD, %) a linearitu GC/MS/MS měření v módu elektronové ionizace (EI).

Cílové analyty

Seznam cílových analytů

Měřené vzorky

  • Směsný standard všech výše uvedených látek o koncentraci 100 ng/ml isooktanu. Standard o koncentraci 100 ng/ml byl následně použit pro přípravu série kalibračních roztoků o koncentraci 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 a 0.005 ng/ml. Kalibrační roztoky byly naředěny do čistého isooktanu.

  • Vzorek povrchové vody (přirozeně kontaminovaný). Vzorek povrchové vody byl následně uměle kontaminován výše uvedeným standardem na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

Instrumentální vybavení – základní informace

Agilent 7010 GC/MS/MS představuje čtvrtou generaci trojitých kvadrupólů (QQQ) společnost Agilent Technologies, který je v kombinaci s plynovým chromatografem (GC) Agilent 7890B/8890 ideálním řešením pro účely vysoce selektivní ultra-stopové kvantitativní analýzy v komplexních matricích. Velmi nízké limity detekce dosažitelné pomocí nového QQQ potvrzuje i deklarovaný detekční limit přístroje (IDL, Instrument Detection Limit) 0,5 fg OFN, jehož dosažení je požadováno při instalaci přístroje a během jeho životnosti. Agilent 7010 GC/MS/MS využívá efektivní ionizaci neutrálních molekul v iontovém zdroji, které jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu, fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele a detekovány v triple-off-axis detektoru.

Obrázek 1-2: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

Plynový chromatograf 7890B/8890 GC přináší vysoce účinnou chromatografickou separaci. Inertní cesta od nástřiku po detektor využívá chemicky deaktivované technologie a spotřební materiál a napomáhá tak dosažení ještě lepší citlivosti vlastní analýzy. Nástřik vzorků je možný prostřednictvím různých typů inletu, jako je split/splitless, PTV či Multi Mode Inlet (MMI), který v sobě kombinuje výhody obou dvou předcházejících typů nástřiku. Turn Top systém těsnění inletů umožňuje výměnu linerů během 30 s bez nutnosti jakýchkoliv nástrojů. Přesná kontrola tlaků/průtoků plynu je umožněna díky použité kapilární fluidní technologii (CFT), která kromě velmi dobré opakovatelnosti výsledků přináší také možnost využití tzv. zpětného toku (backflush), dean switching nebo dělení toku do několika paralelně zapojených detektorů. Zpětný tok (backflush) podporovaný CFT zkracuje dobu analýzy, prodlužuje životnost GC kolony, snižuje riziko carry-over efektu a výrazně snižuje potřebu údržby iontového zdroje, kterou lze doplnit také automatickým čištěním pomocí technologie SCIS (aktivní čištění vodíkem – více detailů v prvním čísle časopisu). V souvislosti s přesnou kontrolou průtoku mobilní fáze lze také implementovat tzv. retention time locking (RTL), který umožňuje dosažení identických retenčních časů nezávisle na operátorovi či údržbě kolony, což výrazně urychluje vlastní analýzu, a to především v případě multireziduálních metod.

Ionty vzniklé v iontovém zdroji jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu s rozsahem hmot až do 1050 amu. Stabilita monolitického kvadrupólu umožňuje zahřívání až na 200 °C, čímž dochází k tepelnému čištění a odstraňování kontaminace běžné u kovových kvadrupólů.

V režimu MS/MS jsou ionty vybrané v prvním kvadrupólu následně fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele pomocí dusíku jako kolizního plynu. Do cely je také přiváděno malé množství tzv. zhášecího plynu (quenching gas), který snižuje množství přítomných metastabilních částic hélia (v případě, že je helium použito jako mobilní fáze). Tyto metastabilní částice navyšují neutrální šum detektoru, který je použitím zhášecího plynu eliminován.

Obrázek 3-5: Multi mode inlet (MMI) - Vyhřívaný zlatý hyperbolický kvadrupól - Triple-axis detektor

K detekci vybraných hmotnostních přechodů či iontů (v případě použití trojitého kvadrupólu jako jednoduchého kvadrupólu) dochází v tzv. triple-axis detektoru. Umístění elektronásobiče dvojitě mimo osu vzhledem ke vstupu iontů do detektoru vede ke snížení šumu a následně i detekčních limitů přístroje.

Software

Ovládání přístroje i následné zpracování dat je kontrolováno pomocí unikátního softwaru MassHunter. MassHunter akviziční software umožňuje měření ve vybraných módech MRM (multiple reaction monitoring), SIM (selected ion monitoring), full scan, scan produktových iontů atd. V rámci MRM měření je možno snímat až 800 MRM přechodů za sekundu s minimálním dwell time 0,5 ms a nulovým cross talk efektem. Ladění a kalibrace přístroje probíhá plně automaticky. Pro rychlé a efektivní zavedení nových MS metod či nových analytů do stávajících metod je možné využít rozsáhlou databázi MRM přechodů pesticidů a environmentálních kontaminantů.

Mass Hunter Quantitative Analysis pro kvantitativní zpracování dat umožňuje tzv. „Batch-at-a-Glance“ náhled na data. Vyhodnocovací metoda je pak tvořena z velké části automaticky na základě informací zadaných v akviziční metodě (MRM přechody pro jednotlivé sloučeniny, názvy sloučenin, retenční čas, typ analytu — vnitřní standard, cílový analyt) a vlastní sekvenci (typ vzorku — kalibrační roztok, vzorek, blank atd.). Reportování výsledků je možno provádět do Excelu nebo je k dispozici velké množství předpřipravených reportů v různých formátech. V případě potřeby je možno formát reportu upravit na míru.

Kvalitativní zpracování dat probíhá v MassHunter Qualitative Analysis. V této části softwaru je možno využívat při měření v MRM módu např. funkci Find Compounds by MRM pro kontrolu retenčních časů, manuální integraci, porovnávání vzorků mezi sebou atd. V případě měření ve full scan módu je možné na základě naměřených spekter provádět např. identifikaci látek ve spojení s vybranou knihovnou spekter (NIST apod.). Z naměřených dat je pak možná i tvorba vlastních knihoven.

Experimentální část

Všechny GC/MS/MS experimenty byly provedeny na plynovém chromatografu Agilent 7890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem Agilent 7010 typu trojitý kvadrupól. Plynový chromatograf byl vybaven autosamplerem Agilent 7693A, multimode inletem (MMI), purge ultimate jednotkou (PUU), která umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a modulem pro pneumatickou kontrolu (pneumatics control modul, PCM). Pro separaci byly využity dvě HP-5 MS UI kapilární kolony (15 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm tloušťka filmu) zapojené za sebou v tzv. mid-column backflush uspořádání. Schématické znázornění celého systému je uvedeno na Obrázku 6.

Obrázek 6 Schématické znázornění systému Purge ultimate union (PUU), který umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a no-vent aplikaci.

Optimalizace GC/MS/MS metody

Pro stanovení všech výše uvedených kontaminantů byla zvolena metoda předdefinovaná v databázi MRM přechodů dodávaná firmou Agilent Technologies. V rámci této databáze jsou kromě MRM přechodů a kolizních energií pro jednotlivé sloučeniny také stanoveny přesné retenční časy. Pro zavedení GC metody byl nejprve proveden tzv. Retention Time Locking s využitím chlorpyrifos-ethylu jako lockovací sloučeniny. V dalším kroku byly z MRM databáze vybrány pro cílové analyty příslušné MRM přechody (3 MRM přechody/1 sloučenina), které byly následně dle zadaných kritérií automaticky rozděleny do jednotlivých časových segmentů, a to s využitím nástroje „Compound List Assistent“. Pro sloučeniny, které nejsou uvedeny v MRM databázi, byly přechody naladěny s využitím dodaného standardu. Na závěr byla provedena optimalizace podmínek nástřiků, byly otestovány módy nástřiku cold splitless (CLS, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). V Tabulce I je uveden přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů.

Tabulka I: Přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů

Parametry GC/MS/MS metody

Parametry GC/MS/MS metody

Sekvence

V rámci experimentu byly změřeny níže uvedené sekvence standardu a vzorku. Pro výpočet opakovatelnosti byly dané standardy a vzorky změřeny 10× za sebou. Na začátku každé sekvence byl proveden nástřik čistého isooktanu pro kontrolu kontaminace pozadí.

Sekvence měření

Výsledky a diskuze

GC/MS/MS metoda

Jak bylo zmíněno výše, většina parametrů GC metody byla převzata z Agilent MRM database přechodů pro pesticidy a environmentální kontaminanty. Tato metoda byla již dříve otestovaná pro analýzu pesticidů a poskytuje velmi dobré chromatografické rozlišení i pro některé standardně koeluující se izomerické sloučeniny, které není možné rozdělit na základě rozdílných MRM přechodů. Větší pozornost byla věnována optimalizaci podmínek nástřiku.

V rámci experimentů byly otestovány různé typy (CSL, HSL, SV) a objemy nástřiku (1 a 2 μl), a to z hlediska tvaru píku, opakovatelnosti nástřiku a dosažených detekčních limitů přístroje (IDL). Z hlediska tvaru píku byly dosaženy dobré výsledky při použití všech typů nástřiků. Ukázky tvaru píku při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny na obrázku v Příloze 1 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz). Opakovatelnost a IDL jsou podrobněji diskutovány níže.

V rámci metody byl využit již dříve zmíněný zpětný proplach kolony, tzv. backflush, který zvyšuje robustnost a dlouhodobou stabilitu celého systému. Zpětný proplach kolony chrání zdroj před méně těkavými složkami vzorku, které jsou ze systému eliminovány přes ventovací kapiláru. Na Obrázku 9 je ukázáno srovnání stability signálu a základní linie při GC/MS/MS měření s/bez zapojení zpětného proplachu kolony.

Obrázek 9: Srovnání stability signálu GC/MS/MS měření (A) bez a (B) s využitím zpětného proplachu kolony.

S ohledem na to, že různé matrice obsahují rozdílné matriční koextrakty, které mohou následně rušit GC/MS/MS analýzu, je v rámci Agilent MRM databáze pro každou sloučeninu dostupných pět a více MRM přechodů tak, aby pro každou matrici bylo možné vybrat MRM přechody bez případných interferencí.

Opakovatelnost

Na základě dat získaných z měření byla stanovená opakovatelnost analýz vyjádřena jako relativní směrodatná odchylka (RSD, %) z deseti po sobě jdoucích nástřiků daného standardu. Detailní přehled vypočtených hodnot je uveden v Tabulce II a III.

Opakovatelnost v závislosti na objemu nástřiku

V Tabulce II je vypočtena opakovatelnost měření při nástřiku 1 μL standardu o koncentraci 10, 1 a 0.1 ng/ml v módu cold splitless (CSL). Z výsledků je patrné, že pro většinu sloučenin byla opakovatelnost na všech třech koncentračních hladinách nižší než 15 %. Na hladině 10, 1 a 0.1 ng/ml se opakovatelnost pohybovala v intervalu 2.8-8.3 %, 5.1-18.8 % a 3.3-16.5 % v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce II označeny červeně) byly dosaženy především na nejnižší testované koncentrační hladině 0.1 ng/ml. Pro látky, které nebylo možné za standardních podmínek na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka II: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při nástřiku 1 μl v modu cold splitless; n = 10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině za standardních podmínek detekovat.

V Tabulce III je uvedeno porovnání opakovatelnosti měření standardu 0.1 ng/ml dosažených při použití různých typů nástřiků – cold splitless (CSL, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). Opakovatelnost se pohybovala v intervalu 2.2-16.5 %, 4.9-15.6 %, 5.3-23.0 % a 2.6-19.8 % při použití CSL 1 μl, CSL 2 μl, HSL 1 μl a SV 2 μl v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce III označeny červeně) byly dosazeny především u sloučenin s vyšším detekčním limitem, tj. hladina 0.1 ng/ml byla velmi blízko jejich detekčního limitu. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka III: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření standardu 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Detekční limit přístroje (IDL)

Detekční limit přístroje (IDL) byl pro všechny analyty vypočten na základě osmi opakování nástřiku standardu 0.1 ng/ml. Výpočet IDL byl proveden s využitím softwaru MassHunter na základě standardního statistického zhodnocení naměřených dat dle vzorce uvedeného níže.

Výpočet detekčního limitu přístroje (IDL)

  • IDL je detekční limit přístroje
  • T je “t” hodnota Studentova rozdělení pro 99% interval spolehlivosti a n-1 stupňů volnosti
  • % RSD je relativní směrodatná odchylka z n opakování

Vypočtené detekční limity přístroje na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny v Tabulce IV. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A a jejich výpočet IDL byl proveden na základě měření standardu o koncentraci 1 ng/ml (viz Tabulka IV – sloupec s označením 1 ng/ml CSL 1 μl). Z výsledků je patrné, ze nejnižší IDL byl pro většinu sloučenin dosažen při použití nástřiku 1 μl v módu cold splitless. Při použití tohoto typu nástřiku se IDL pro všechny detekované sloučeniny pohyboval v intervalu 0.001-0.109 ng/ml. Nástřik 1 μl v cold splitless módu byl dále použit pro analýzu reálného vzorku potoční vody.

Tabulka IV: Přehled vypočtených IDL (ng/ml) na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Lineární dynamický rozsah

Linearita měření byla vyjádřena jako regresní koeficient (R2) vypočtený pro kalibrační křivku v oblasti od nejnižšího kalibračního bodu do 100 ng/ml. Pro všechny analyty se regresní koeficient pohyboval v intervalu 0.9965 - 0.9999. Ukázka kalibrační křivky pro hexachlorbenzen je uvedena na Obrázku 11. Ukázky chromatogramu nejnižších kalibračních bodů pro jednotlivé sloučeniny jsou uvedeny na obrázku v Příloze 3 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Obrázek 11: Ukázka kalibrační křivky – hexachlorbenzen, 0.005-100 ng/ml, 10 bodů, R2 = 0.9997

Měření vzorků potoční vody – opakovatelnost

Na základě předchozích měření roztoku standardu 0.1 ng/ml byl pro závěrečné měření reálného vzorku potoční vody vybrán nástřik o objemu 1 μl v módu cold splitless. V rámci měření reálných vzorků byl každý vzorek změřen desetkrát. Nejprve byl změřen přirozeně kontaminovaný vzorek potoční vody, který byl následně uměle kontaminován na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

U reálně kontaminovaného vzorku 5 se opakovatelnost (RSD, %) u detekovaných sloučenin pohybovala v intervalu 5.9-23.9%. Relativně vysokých RSD (%) bylo dosaženo z důvodu velmi nízkých koncentračních hladin, na kterých byl vzorek kontaminován, tj. zjištěné koncentrace byly velmi blízko detekčního limitu. Stejný trend lze pak sledovat i u uměle kontaminovaných vzorků. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce V označeny červeně) byly dosaženy především u sloučenin s vyššími detekčními limity. Pro látky, které nebylo možné v daném vzorku detekovat, je v tabulce uvedeno N/A. Ukázky chromatogramů reálně a uměle kontaminovaného vzorku potoční vody jsou uvedeny v Příloze 2 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Tabulka V: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření reálně (Vzorek 5) a uměle kontaminovaného vzorku (SP1, SP2, SP3) potoční vody při nástřiků 1 μl v módu cold splitless; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné v daném vzorku detekovat.

Závěr

Na základě výsledků získaných základním testováním výkonu nového GC/MS/MS systému Agilent Technologies 7010 Series lze reálně zhodnotit skutečné detekční limity pro vybrané analyty na základě získaných % RSD, které jsou, společně se skutečnými chromatografickými záznamy, nejvhodnějším způsobem objektivního zhodnocení reálných možností stroje. Konfigurace stroje využívající technologie pro vysokou robustnost a dlouhodobou stabilitu jako např. CFT - backflush modul ukazují, že tyto prvky patří k neoddělitelným součástem konfigurací především u instrumentů určených pro ultrastopovou analýzu ve složitých matricích.

Multimode/PTV injektor dále umožňuje v případě potřeby ještě výrazněji posunout detekční limity nástřikem většího objemu vzorku, a to běžně 4 – 8 nebo i 25 a více mikrolitrů v závislosti na typu matrice a potřebných detekčních limitech.

Výhodou vysoké citlivosti modelu 7010 Series a tedy možnosti nastřikovat menší objemy vzorků (především těch s komplikovanou matricí) přináší výrazně nižší kontaminaci systému, delší životnost spotřebního materiálu (linery, kolony), což snižuje celkové provozní náklady a výrazně snižuje také potřebu údržby a čištění především iontového zdroje samotného MS/MS detektoru.

V případě minimalizace manuální údržby celého systému a potřeby udržení maximálního výkonu MS/MS detektoru lze systém vybavit technologií SCIS (Self Cleaning Ion Source), která využívá reaktivity vodíku přidávaného do iontového zdroje ve velice malých množstvích, čímž udržuje iontový zdroj kontinuálně čistý, nebo aktivně v potřebných intervalech iontový zdroj čistí nezávisle na samotných analýzách.

HPST
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluation of Ultra High Resolution Mass Spectrometer in Targeted Forensic Screening Method for Urine Analysis in Comparison to Immunoassay and GC-MS Techniques

Postery
| N/A | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie, Klinická analýza

Mass Spectrometry Applications for Environmental Analysis

Příručky
| 2014 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, Příprava vzorků, GC/SQ, GC/QQQ, HPLC, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap, LC/QQQ, IC-MS, IC/MS/MS, LC-SQ, LC/IT
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

Food Safety Applications NotebookEnvironmental Contaminants - Environmental Contaminants

Příručky
| 2012 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC, Příprava vzorků, Spotřební materiál, Iontová chromatografie, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies, Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

STANOVENÍ AROMATICKÝCH ALKOHOLŮ V PIVU S VYUŽITÍM METODY EXTRAKCE NA PEVNÉ FÁZI (SPE) A DETEKCE POMOCÍ SPOJENÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (GC-MS) Část I. – Vypracování a validace vhodné analytické metody

V úvodní části jsou krátce shrnuty poznatky týkající se analytických postupů stanovení aromatických alkoholů a doplněny o stručnou literární rešerši věnovanou jejich vzniku, úloze a senzorickým účinkům v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení izomerů nižších mastných kyselin, senzoricky aktivních produktů stárnutí chmele, v pivu

Citlivá metoda založená na izolaci nižších mastných kyselin a jejich izomerů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a kvantitativním vyhodnocení pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS).
Agilent 7010 GC/MS/MS trojitý kvadrupól v analýze environmentálních kontaminantů
Út, 19.5.2020
| Originální článek z: HPST/Trojitý (triple) kvadrupól (QQQ)
Komplexní výsledky reálného demo měření aplikačních specialistů HPST pro 41 enviro kontaminantů a vzorků povrchových vod pomocí GC/QQQ Agilent 7010 series.

HPST: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

V rámci uskutečněného měření byla provedena analýza 41 environmentálních kontaminantů v rozpouštědlových standardech na deseti koncentračních hladinách a ve vzorku povrchové vody (přirozené/uměle kontaminované). Všechna měření byla provedena s využitím plynového chromatografu Agilent 7890/8890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitý kvadrupól Agilent 7010 MS/MS. Cílem experimentů bylo stanovit limity detekce pro jednotlivé sloučeniny ve standardech rozpouštědel a připravených extraktech povrchové vody a určit opakovatelnost (RSD, %) a linearitu GC/MS/MS měření v módu elektronové ionizace (EI).

Cílové analyty

Seznam cílových analytů

Měřené vzorky

  • Směsný standard všech výše uvedených látek o koncentraci 100 ng/ml isooktanu. Standard o koncentraci 100 ng/ml byl následně použit pro přípravu série kalibračních roztoků o koncentraci 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 a 0.005 ng/ml. Kalibrační roztoky byly naředěny do čistého isooktanu.

  • Vzorek povrchové vody (přirozeně kontaminovaný). Vzorek povrchové vody byl následně uměle kontaminován výše uvedeným standardem na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

Instrumentální vybavení – základní informace

Agilent 7010 GC/MS/MS představuje čtvrtou generaci trojitých kvadrupólů (QQQ) společnost Agilent Technologies, který je v kombinaci s plynovým chromatografem (GC) Agilent 7890B/8890 ideálním řešením pro účely vysoce selektivní ultra-stopové kvantitativní analýzy v komplexních matricích. Velmi nízké limity detekce dosažitelné pomocí nového QQQ potvrzuje i deklarovaný detekční limit přístroje (IDL, Instrument Detection Limit) 0,5 fg OFN, jehož dosažení je požadováno při instalaci přístroje a během jeho životnosti. Agilent 7010 GC/MS/MS využívá efektivní ionizaci neutrálních molekul v iontovém zdroji, které jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu, fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele a detekovány v triple-off-axis detektoru.

Obrázek 1-2: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

Plynový chromatograf 7890B/8890 GC přináší vysoce účinnou chromatografickou separaci. Inertní cesta od nástřiku po detektor využívá chemicky deaktivované technologie a spotřební materiál a napomáhá tak dosažení ještě lepší citlivosti vlastní analýzy. Nástřik vzorků je možný prostřednictvím různých typů inletu, jako je split/splitless, PTV či Multi Mode Inlet (MMI), který v sobě kombinuje výhody obou dvou předcházejících typů nástřiku. Turn Top systém těsnění inletů umožňuje výměnu linerů během 30 s bez nutnosti jakýchkoliv nástrojů. Přesná kontrola tlaků/průtoků plynu je umožněna díky použité kapilární fluidní technologii (CFT), která kromě velmi dobré opakovatelnosti výsledků přináší také možnost využití tzv. zpětného toku (backflush), dean switching nebo dělení toku do několika paralelně zapojených detektorů. Zpětný tok (backflush) podporovaný CFT zkracuje dobu analýzy, prodlužuje životnost GC kolony, snižuje riziko carry-over efektu a výrazně snižuje potřebu údržby iontového zdroje, kterou lze doplnit také automatickým čištěním pomocí technologie SCIS (aktivní čištění vodíkem – více detailů v prvním čísle časopisu). V souvislosti s přesnou kontrolou průtoku mobilní fáze lze také implementovat tzv. retention time locking (RTL), který umožňuje dosažení identických retenčních časů nezávisle na operátorovi či údržbě kolony, což výrazně urychluje vlastní analýzu, a to především v případě multireziduálních metod.

Ionty vzniklé v iontovém zdroji jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu s rozsahem hmot až do 1050 amu. Stabilita monolitického kvadrupólu umožňuje zahřívání až na 200 °C, čímž dochází k tepelnému čištění a odstraňování kontaminace běžné u kovových kvadrupólů.

V režimu MS/MS jsou ionty vybrané v prvním kvadrupólu následně fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele pomocí dusíku jako kolizního plynu. Do cely je také přiváděno malé množství tzv. zhášecího plynu (quenching gas), který snižuje množství přítomných metastabilních částic hélia (v případě, že je helium použito jako mobilní fáze). Tyto metastabilní částice navyšují neutrální šum detektoru, který je použitím zhášecího plynu eliminován.

Obrázek 3-5: Multi mode inlet (MMI) - Vyhřívaný zlatý hyperbolický kvadrupól - Triple-axis detektor

K detekci vybraných hmotnostních přechodů či iontů (v případě použití trojitého kvadrupólu jako jednoduchého kvadrupólu) dochází v tzv. triple-axis detektoru. Umístění elektronásobiče dvojitě mimo osu vzhledem ke vstupu iontů do detektoru vede ke snížení šumu a následně i detekčních limitů přístroje.

Software

Ovládání přístroje i následné zpracování dat je kontrolováno pomocí unikátního softwaru MassHunter. MassHunter akviziční software umožňuje měření ve vybraných módech MRM (multiple reaction monitoring), SIM (selected ion monitoring), full scan, scan produktových iontů atd. V rámci MRM měření je možno snímat až 800 MRM přechodů za sekundu s minimálním dwell time 0,5 ms a nulovým cross talk efektem. Ladění a kalibrace přístroje probíhá plně automaticky. Pro rychlé a efektivní zavedení nových MS metod či nových analytů do stávajících metod je možné využít rozsáhlou databázi MRM přechodů pesticidů a environmentálních kontaminantů.

Mass Hunter Quantitative Analysis pro kvantitativní zpracování dat umožňuje tzv. „Batch-at-a-Glance“ náhled na data. Vyhodnocovací metoda je pak tvořena z velké části automaticky na základě informací zadaných v akviziční metodě (MRM přechody pro jednotlivé sloučeniny, názvy sloučenin, retenční čas, typ analytu — vnitřní standard, cílový analyt) a vlastní sekvenci (typ vzorku — kalibrační roztok, vzorek, blank atd.). Reportování výsledků je možno provádět do Excelu nebo je k dispozici velké množství předpřipravených reportů v různých formátech. V případě potřeby je možno formát reportu upravit na míru.

Kvalitativní zpracování dat probíhá v MassHunter Qualitative Analysis. V této části softwaru je možno využívat při měření v MRM módu např. funkci Find Compounds by MRM pro kontrolu retenčních časů, manuální integraci, porovnávání vzorků mezi sebou atd. V případě měření ve full scan módu je možné na základě naměřených spekter provádět např. identifikaci látek ve spojení s vybranou knihovnou spekter (NIST apod.). Z naměřených dat je pak možná i tvorba vlastních knihoven.

Experimentální část

Všechny GC/MS/MS experimenty byly provedeny na plynovém chromatografu Agilent 7890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem Agilent 7010 typu trojitý kvadrupól. Plynový chromatograf byl vybaven autosamplerem Agilent 7693A, multimode inletem (MMI), purge ultimate jednotkou (PUU), která umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a modulem pro pneumatickou kontrolu (pneumatics control modul, PCM). Pro separaci byly využity dvě HP-5 MS UI kapilární kolony (15 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm tloušťka filmu) zapojené za sebou v tzv. mid-column backflush uspořádání. Schématické znázornění celého systému je uvedeno na Obrázku 6.

Obrázek 6 Schématické znázornění systému Purge ultimate union (PUU), který umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a no-vent aplikaci.

Optimalizace GC/MS/MS metody

Pro stanovení všech výše uvedených kontaminantů byla zvolena metoda předdefinovaná v databázi MRM přechodů dodávaná firmou Agilent Technologies. V rámci této databáze jsou kromě MRM přechodů a kolizních energií pro jednotlivé sloučeniny také stanoveny přesné retenční časy. Pro zavedení GC metody byl nejprve proveden tzv. Retention Time Locking s využitím chlorpyrifos-ethylu jako lockovací sloučeniny. V dalším kroku byly z MRM databáze vybrány pro cílové analyty příslušné MRM přechody (3 MRM přechody/1 sloučenina), které byly následně dle zadaných kritérií automaticky rozděleny do jednotlivých časových segmentů, a to s využitím nástroje „Compound List Assistent“. Pro sloučeniny, které nejsou uvedeny v MRM databázi, byly přechody naladěny s využitím dodaného standardu. Na závěr byla provedena optimalizace podmínek nástřiků, byly otestovány módy nástřiku cold splitless (CLS, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). V Tabulce I je uveden přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů.

Tabulka I: Přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů

Parametry GC/MS/MS metody

Parametry GC/MS/MS metody

Sekvence

V rámci experimentu byly změřeny níže uvedené sekvence standardu a vzorku. Pro výpočet opakovatelnosti byly dané standardy a vzorky změřeny 10× za sebou. Na začátku každé sekvence byl proveden nástřik čistého isooktanu pro kontrolu kontaminace pozadí.

Sekvence měření

Výsledky a diskuze

GC/MS/MS metoda

Jak bylo zmíněno výše, většina parametrů GC metody byla převzata z Agilent MRM database přechodů pro pesticidy a environmentální kontaminanty. Tato metoda byla již dříve otestovaná pro analýzu pesticidů a poskytuje velmi dobré chromatografické rozlišení i pro některé standardně koeluující se izomerické sloučeniny, které není možné rozdělit na základě rozdílných MRM přechodů. Větší pozornost byla věnována optimalizaci podmínek nástřiku.

V rámci experimentů byly otestovány různé typy (CSL, HSL, SV) a objemy nástřiku (1 a 2 μl), a to z hlediska tvaru píku, opakovatelnosti nástřiku a dosažených detekčních limitů přístroje (IDL). Z hlediska tvaru píku byly dosaženy dobré výsledky při použití všech typů nástřiků. Ukázky tvaru píku při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny na obrázku v Příloze 1 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz). Opakovatelnost a IDL jsou podrobněji diskutovány níže.

V rámci metody byl využit již dříve zmíněný zpětný proplach kolony, tzv. backflush, který zvyšuje robustnost a dlouhodobou stabilitu celého systému. Zpětný proplach kolony chrání zdroj před méně těkavými složkami vzorku, které jsou ze systému eliminovány přes ventovací kapiláru. Na Obrázku 9 je ukázáno srovnání stability signálu a základní linie při GC/MS/MS měření s/bez zapojení zpětného proplachu kolony.

Obrázek 9: Srovnání stability signálu GC/MS/MS měření (A) bez a (B) s využitím zpětného proplachu kolony.

S ohledem na to, že různé matrice obsahují rozdílné matriční koextrakty, které mohou následně rušit GC/MS/MS analýzu, je v rámci Agilent MRM databáze pro každou sloučeninu dostupných pět a více MRM přechodů tak, aby pro každou matrici bylo možné vybrat MRM přechody bez případných interferencí.

Opakovatelnost

Na základě dat získaných z měření byla stanovená opakovatelnost analýz vyjádřena jako relativní směrodatná odchylka (RSD, %) z deseti po sobě jdoucích nástřiků daného standardu. Detailní přehled vypočtených hodnot je uveden v Tabulce II a III.

Opakovatelnost v závislosti na objemu nástřiku

V Tabulce II je vypočtena opakovatelnost měření při nástřiku 1 μL standardu o koncentraci 10, 1 a 0.1 ng/ml v módu cold splitless (CSL). Z výsledků je patrné, že pro většinu sloučenin byla opakovatelnost na všech třech koncentračních hladinách nižší než 15 %. Na hladině 10, 1 a 0.1 ng/ml se opakovatelnost pohybovala v intervalu 2.8-8.3 %, 5.1-18.8 % a 3.3-16.5 % v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce II označeny červeně) byly dosaženy především na nejnižší testované koncentrační hladině 0.1 ng/ml. Pro látky, které nebylo možné za standardních podmínek na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka II: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při nástřiku 1 μl v modu cold splitless; n = 10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině za standardních podmínek detekovat.

V Tabulce III je uvedeno porovnání opakovatelnosti měření standardu 0.1 ng/ml dosažených při použití různých typů nástřiků – cold splitless (CSL, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). Opakovatelnost se pohybovala v intervalu 2.2-16.5 %, 4.9-15.6 %, 5.3-23.0 % a 2.6-19.8 % při použití CSL 1 μl, CSL 2 μl, HSL 1 μl a SV 2 μl v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce III označeny červeně) byly dosazeny především u sloučenin s vyšším detekčním limitem, tj. hladina 0.1 ng/ml byla velmi blízko jejich detekčního limitu. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka III: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření standardu 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Detekční limit přístroje (IDL)

Detekční limit přístroje (IDL) byl pro všechny analyty vypočten na základě osmi opakování nástřiku standardu 0.1 ng/ml. Výpočet IDL byl proveden s využitím softwaru MassHunter na základě standardního statistického zhodnocení naměřených dat dle vzorce uvedeného níže.

Výpočet detekčního limitu přístroje (IDL)

  • IDL je detekční limit přístroje
  • T je “t” hodnota Studentova rozdělení pro 99% interval spolehlivosti a n-1 stupňů volnosti
  • % RSD je relativní směrodatná odchylka z n opakování

Vypočtené detekční limity přístroje na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny v Tabulce IV. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A a jejich výpočet IDL byl proveden na základě měření standardu o koncentraci 1 ng/ml (viz Tabulka IV – sloupec s označením 1 ng/ml CSL 1 μl). Z výsledků je patrné, ze nejnižší IDL byl pro většinu sloučenin dosažen při použití nástřiku 1 μl v módu cold splitless. Při použití tohoto typu nástřiku se IDL pro všechny detekované sloučeniny pohyboval v intervalu 0.001-0.109 ng/ml. Nástřik 1 μl v cold splitless módu byl dále použit pro analýzu reálného vzorku potoční vody.

Tabulka IV: Přehled vypočtených IDL (ng/ml) na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Lineární dynamický rozsah

Linearita měření byla vyjádřena jako regresní koeficient (R2) vypočtený pro kalibrační křivku v oblasti od nejnižšího kalibračního bodu do 100 ng/ml. Pro všechny analyty se regresní koeficient pohyboval v intervalu 0.9965 - 0.9999. Ukázka kalibrační křivky pro hexachlorbenzen je uvedena na Obrázku 11. Ukázky chromatogramu nejnižších kalibračních bodů pro jednotlivé sloučeniny jsou uvedeny na obrázku v Příloze 3 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Obrázek 11: Ukázka kalibrační křivky – hexachlorbenzen, 0.005-100 ng/ml, 10 bodů, R2 = 0.9997

Měření vzorků potoční vody – opakovatelnost

Na základě předchozích měření roztoku standardu 0.1 ng/ml byl pro závěrečné měření reálného vzorku potoční vody vybrán nástřik o objemu 1 μl v módu cold splitless. V rámci měření reálných vzorků byl každý vzorek změřen desetkrát. Nejprve byl změřen přirozeně kontaminovaný vzorek potoční vody, který byl následně uměle kontaminován na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

U reálně kontaminovaného vzorku 5 se opakovatelnost (RSD, %) u detekovaných sloučenin pohybovala v intervalu 5.9-23.9%. Relativně vysokých RSD (%) bylo dosaženo z důvodu velmi nízkých koncentračních hladin, na kterých byl vzorek kontaminován, tj. zjištěné koncentrace byly velmi blízko detekčního limitu. Stejný trend lze pak sledovat i u uměle kontaminovaných vzorků. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce V označeny červeně) byly dosaženy především u sloučenin s vyššími detekčními limity. Pro látky, které nebylo možné v daném vzorku detekovat, je v tabulce uvedeno N/A. Ukázky chromatogramů reálně a uměle kontaminovaného vzorku potoční vody jsou uvedeny v Příloze 2 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Tabulka V: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření reálně (Vzorek 5) a uměle kontaminovaného vzorku (SP1, SP2, SP3) potoční vody při nástřiků 1 μl v módu cold splitless; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné v daném vzorku detekovat.

Závěr

Na základě výsledků získaných základním testováním výkonu nového GC/MS/MS systému Agilent Technologies 7010 Series lze reálně zhodnotit skutečné detekční limity pro vybrané analyty na základě získaných % RSD, které jsou, společně se skutečnými chromatografickými záznamy, nejvhodnějším způsobem objektivního zhodnocení reálných možností stroje. Konfigurace stroje využívající technologie pro vysokou robustnost a dlouhodobou stabilitu jako např. CFT - backflush modul ukazují, že tyto prvky patří k neoddělitelným součástem konfigurací především u instrumentů určených pro ultrastopovou analýzu ve složitých matricích.

Multimode/PTV injektor dále umožňuje v případě potřeby ještě výrazněji posunout detekční limity nástřikem většího objemu vzorku, a to běžně 4 – 8 nebo i 25 a více mikrolitrů v závislosti na typu matrice a potřebných detekčních limitech.

Výhodou vysoké citlivosti modelu 7010 Series a tedy možnosti nastřikovat menší objemy vzorků (především těch s komplikovanou matricí) přináší výrazně nižší kontaminaci systému, delší životnost spotřebního materiálu (linery, kolony), což snižuje celkové provozní náklady a výrazně snižuje také potřebu údržby a čištění především iontového zdroje samotného MS/MS detektoru.

V případě minimalizace manuální údržby celého systému a potřeby udržení maximálního výkonu MS/MS detektoru lze systém vybavit technologií SCIS (Self Cleaning Ion Source), která využívá reaktivity vodíku přidávaného do iontového zdroje ve velice malých množstvích, čímž udržuje iontový zdroj kontinuálně čistý, nebo aktivně v potřebných intervalech iontový zdroj čistí nezávisle na samotných analýzách.

HPST
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluation of Ultra High Resolution Mass Spectrometer in Targeted Forensic Screening Method for Urine Analysis in Comparison to Immunoassay and GC-MS Techniques

Postery
| N/A | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie, Klinická analýza

Mass Spectrometry Applications for Environmental Analysis

Příručky
| 2014 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, Příprava vzorků, GC/SQ, GC/QQQ, HPLC, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap, LC/QQQ, IC-MS, IC/MS/MS, LC-SQ, LC/IT
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

Food Safety Applications NotebookEnvironmental Contaminants - Environmental Contaminants

Příručky
| 2012 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC, Příprava vzorků, Spotřební materiál, Iontová chromatografie, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies, Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

STANOVENÍ AROMATICKÝCH ALKOHOLŮ V PIVU S VYUŽITÍM METODY EXTRAKCE NA PEVNÉ FÁZI (SPE) A DETEKCE POMOCÍ SPOJENÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (GC-MS) Část I. – Vypracování a validace vhodné analytické metody

V úvodní části jsou krátce shrnuty poznatky týkající se analytických postupů stanovení aromatických alkoholů a doplněny o stručnou literární rešerši věnovanou jejich vzniku, úloze a senzorickým účinkům v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení izomerů nižších mastných kyselin, senzoricky aktivních produktů stárnutí chmele, v pivu

Citlivá metoda založená na izolaci nižších mastných kyselin a jejich izomerů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a kvantitativním vyhodnocení pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS).
Agilent 7010 GC/MS/MS trojitý kvadrupól v analýze environmentálních kontaminantů
Út, 19.5.2020
| Originální článek z: HPST/Trojitý (triple) kvadrupól (QQQ)
Komplexní výsledky reálného demo měření aplikačních specialistů HPST pro 41 enviro kontaminantů a vzorků povrchových vod pomocí GC/QQQ Agilent 7010 series.

HPST: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

V rámci uskutečněného měření byla provedena analýza 41 environmentálních kontaminantů v rozpouštědlových standardech na deseti koncentračních hladinách a ve vzorku povrchové vody (přirozené/uměle kontaminované). Všechna měření byla provedena s využitím plynového chromatografu Agilent 7890/8890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitý kvadrupól Agilent 7010 MS/MS. Cílem experimentů bylo stanovit limity detekce pro jednotlivé sloučeniny ve standardech rozpouštědel a připravených extraktech povrchové vody a určit opakovatelnost (RSD, %) a linearitu GC/MS/MS měření v módu elektronové ionizace (EI).

Cílové analyty

Seznam cílových analytů

Měřené vzorky

  • Směsný standard všech výše uvedených látek o koncentraci 100 ng/ml isooktanu. Standard o koncentraci 100 ng/ml byl následně použit pro přípravu série kalibračních roztoků o koncentraci 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 a 0.005 ng/ml. Kalibrační roztoky byly naředěny do čistého isooktanu.

  • Vzorek povrchové vody (přirozeně kontaminovaný). Vzorek povrchové vody byl následně uměle kontaminován výše uvedeným standardem na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

Instrumentální vybavení – základní informace

Agilent 7010 GC/MS/MS představuje čtvrtou generaci trojitých kvadrupólů (QQQ) společnost Agilent Technologies, který je v kombinaci s plynovým chromatografem (GC) Agilent 7890B/8890 ideálním řešením pro účely vysoce selektivní ultra-stopové kvantitativní analýzy v komplexních matricích. Velmi nízké limity detekce dosažitelné pomocí nového QQQ potvrzuje i deklarovaný detekční limit přístroje (IDL, Instrument Detection Limit) 0,5 fg OFN, jehož dosažení je požadováno při instalaci přístroje a během jeho životnosti. Agilent 7010 GC/MS/MS využívá efektivní ionizaci neutrálních molekul v iontovém zdroji, které jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu, fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele a detekovány v triple-off-axis detektoru.

Obrázek 1-2: Agilent 8890/7010B GC/MS/MS systém

Plynový chromatograf 7890B/8890 GC přináší vysoce účinnou chromatografickou separaci. Inertní cesta od nástřiku po detektor využívá chemicky deaktivované technologie a spotřební materiál a napomáhá tak dosažení ještě lepší citlivosti vlastní analýzy. Nástřik vzorků je možný prostřednictvím různých typů inletu, jako je split/splitless, PTV či Multi Mode Inlet (MMI), který v sobě kombinuje výhody obou dvou předcházejících typů nástřiku. Turn Top systém těsnění inletů umožňuje výměnu linerů během 30 s bez nutnosti jakýchkoliv nástrojů. Přesná kontrola tlaků/průtoků plynu je umožněna díky použité kapilární fluidní technologii (CFT), která kromě velmi dobré opakovatelnosti výsledků přináší také možnost využití tzv. zpětného toku (backflush), dean switching nebo dělení toku do několika paralelně zapojených detektorů. Zpětný tok (backflush) podporovaný CFT zkracuje dobu analýzy, prodlužuje životnost GC kolony, snižuje riziko carry-over efektu a výrazně snižuje potřebu údržby iontového zdroje, kterou lze doplnit také automatickým čištěním pomocí technologie SCIS (aktivní čištění vodíkem – více detailů v prvním čísle časopisu). V souvislosti s přesnou kontrolou průtoku mobilní fáze lze také implementovat tzv. retention time locking (RTL), který umožňuje dosažení identických retenčních časů nezávisle na operátorovi či údržbě kolony, což výrazně urychluje vlastní analýzu, a to především v případě multireziduálních metod.

Ionty vzniklé v iontovém zdroji jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu s rozsahem hmot až do 1050 amu. Stabilita monolitického kvadrupólu umožňuje zahřívání až na 200 °C, čímž dochází k tepelnému čištění a odstraňování kontaminace běžné u kovových kvadrupólů.

V režimu MS/MS jsou ionty vybrané v prvním kvadrupólu následně fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele pomocí dusíku jako kolizního plynu. Do cely je také přiváděno malé množství tzv. zhášecího plynu (quenching gas), který snižuje množství přítomných metastabilních částic hélia (v případě, že je helium použito jako mobilní fáze). Tyto metastabilní částice navyšují neutrální šum detektoru, který je použitím zhášecího plynu eliminován.

Obrázek 3-5: Multi mode inlet (MMI) - Vyhřívaný zlatý hyperbolický kvadrupól - Triple-axis detektor

K detekci vybraných hmotnostních přechodů či iontů (v případě použití trojitého kvadrupólu jako jednoduchého kvadrupólu) dochází v tzv. triple-axis detektoru. Umístění elektronásobiče dvojitě mimo osu vzhledem ke vstupu iontů do detektoru vede ke snížení šumu a následně i detekčních limitů přístroje.

Software

Ovládání přístroje i následné zpracování dat je kontrolováno pomocí unikátního softwaru MassHunter. MassHunter akviziční software umožňuje měření ve vybraných módech MRM (multiple reaction monitoring), SIM (selected ion monitoring), full scan, scan produktových iontů atd. V rámci MRM měření je možno snímat až 800 MRM přechodů za sekundu s minimálním dwell time 0,5 ms a nulovým cross talk efektem. Ladění a kalibrace přístroje probíhá plně automaticky. Pro rychlé a efektivní zavedení nových MS metod či nových analytů do stávajících metod je možné využít rozsáhlou databázi MRM přechodů pesticidů a environmentálních kontaminantů.

Mass Hunter Quantitative Analysis pro kvantitativní zpracování dat umožňuje tzv. „Batch-at-a-Glance“ náhled na data. Vyhodnocovací metoda je pak tvořena z velké části automaticky na základě informací zadaných v akviziční metodě (MRM přechody pro jednotlivé sloučeniny, názvy sloučenin, retenční čas, typ analytu — vnitřní standard, cílový analyt) a vlastní sekvenci (typ vzorku — kalibrační roztok, vzorek, blank atd.). Reportování výsledků je možno provádět do Excelu nebo je k dispozici velké množství předpřipravených reportů v různých formátech. V případě potřeby je možno formát reportu upravit na míru.

Kvalitativní zpracování dat probíhá v MassHunter Qualitative Analysis. V této části softwaru je možno využívat při měření v MRM módu např. funkci Find Compounds by MRM pro kontrolu retenčních časů, manuální integraci, porovnávání vzorků mezi sebou atd. V případě měření ve full scan módu je možné na základě naměřených spekter provádět např. identifikaci látek ve spojení s vybranou knihovnou spekter (NIST apod.). Z naměřených dat je pak možná i tvorba vlastních knihoven.

Experimentální část

Všechny GC/MS/MS experimenty byly provedeny na plynovém chromatografu Agilent 7890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem Agilent 7010 typu trojitý kvadrupól. Plynový chromatograf byl vybaven autosamplerem Agilent 7693A, multimode inletem (MMI), purge ultimate jednotkou (PUU), která umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a modulem pro pneumatickou kontrolu (pneumatics control modul, PCM). Pro separaci byly využity dvě HP-5 MS UI kapilární kolony (15 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm tloušťka filmu) zapojené za sebou v tzv. mid-column backflush uspořádání. Schématické znázornění celého systému je uvedeno na Obrázku 6.

Obrázek 6 Schématické znázornění systému Purge ultimate union (PUU), který umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a no-vent aplikaci.

Optimalizace GC/MS/MS metody

Pro stanovení všech výše uvedených kontaminantů byla zvolena metoda předdefinovaná v databázi MRM přechodů dodávaná firmou Agilent Technologies. V rámci této databáze jsou kromě MRM přechodů a kolizních energií pro jednotlivé sloučeniny také stanoveny přesné retenční časy. Pro zavedení GC metody byl nejprve proveden tzv. Retention Time Locking s využitím chlorpyrifos-ethylu jako lockovací sloučeniny. V dalším kroku byly z MRM databáze vybrány pro cílové analyty příslušné MRM přechody (3 MRM přechody/1 sloučenina), které byly následně dle zadaných kritérií automaticky rozděleny do jednotlivých časových segmentů, a to s využitím nástroje „Compound List Assistent“. Pro sloučeniny, které nejsou uvedeny v MRM databázi, byly přechody naladěny s využitím dodaného standardu. Na závěr byla provedena optimalizace podmínek nástřiků, byly otestovány módy nástřiku cold splitless (CLS, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). V Tabulce I je uveden přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů.

Tabulka I: Přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů

Parametry GC/MS/MS metody

Parametry GC/MS/MS metody

Sekvence

V rámci experimentu byly změřeny níže uvedené sekvence standardu a vzorku. Pro výpočet opakovatelnosti byly dané standardy a vzorky změřeny 10× za sebou. Na začátku každé sekvence byl proveden nástřik čistého isooktanu pro kontrolu kontaminace pozadí.

Sekvence měření

Výsledky a diskuze

GC/MS/MS metoda

Jak bylo zmíněno výše, většina parametrů GC metody byla převzata z Agilent MRM database přechodů pro pesticidy a environmentální kontaminanty. Tato metoda byla již dříve otestovaná pro analýzu pesticidů a poskytuje velmi dobré chromatografické rozlišení i pro některé standardně koeluující se izomerické sloučeniny, které není možné rozdělit na základě rozdílných MRM přechodů. Větší pozornost byla věnována optimalizaci podmínek nástřiku.

V rámci experimentů byly otestovány různé typy (CSL, HSL, SV) a objemy nástřiku (1 a 2 μl), a to z hlediska tvaru píku, opakovatelnosti nástřiku a dosažených detekčních limitů přístroje (IDL). Z hlediska tvaru píku byly dosaženy dobré výsledky při použití všech typů nástřiků. Ukázky tvaru píku při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny na obrázku v Příloze 1 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz). Opakovatelnost a IDL jsou podrobněji diskutovány níže.

V rámci metody byl využit již dříve zmíněný zpětný proplach kolony, tzv. backflush, který zvyšuje robustnost a dlouhodobou stabilitu celého systému. Zpětný proplach kolony chrání zdroj před méně těkavými složkami vzorku, které jsou ze systému eliminovány přes ventovací kapiláru. Na Obrázku 9 je ukázáno srovnání stability signálu a základní linie při GC/MS/MS měření s/bez zapojení zpětného proplachu kolony.

Obrázek 9: Srovnání stability signálu GC/MS/MS měření (A) bez a (B) s využitím zpětného proplachu kolony.

S ohledem na to, že různé matrice obsahují rozdílné matriční koextrakty, které mohou následně rušit GC/MS/MS analýzu, je v rámci Agilent MRM databáze pro každou sloučeninu dostupných pět a více MRM přechodů tak, aby pro každou matrici bylo možné vybrat MRM přechody bez případných interferencí.

Opakovatelnost

Na základě dat získaných z měření byla stanovená opakovatelnost analýz vyjádřena jako relativní směrodatná odchylka (RSD, %) z deseti po sobě jdoucích nástřiků daného standardu. Detailní přehled vypočtených hodnot je uveden v Tabulce II a III.

Opakovatelnost v závislosti na objemu nástřiku

V Tabulce II je vypočtena opakovatelnost měření při nástřiku 1 μL standardu o koncentraci 10, 1 a 0.1 ng/ml v módu cold splitless (CSL). Z výsledků je patrné, že pro většinu sloučenin byla opakovatelnost na všech třech koncentračních hladinách nižší než 15 %. Na hladině 10, 1 a 0.1 ng/ml se opakovatelnost pohybovala v intervalu 2.8-8.3 %, 5.1-18.8 % a 3.3-16.5 % v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce II označeny červeně) byly dosaženy především na nejnižší testované koncentrační hladině 0.1 ng/ml. Pro látky, které nebylo možné za standardních podmínek na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka II: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při nástřiku 1 μl v modu cold splitless; n = 10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině za standardních podmínek detekovat.

V Tabulce III je uvedeno porovnání opakovatelnosti měření standardu 0.1 ng/ml dosažených při použití různých typů nástřiků – cold splitless (CSL, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). Opakovatelnost se pohybovala v intervalu 2.2-16.5 %, 4.9-15.6 %, 5.3-23.0 % a 2.6-19.8 % při použití CSL 1 μl, CSL 2 μl, HSL 1 μl a SV 2 μl v uvedeném pořadí. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce III označeny červeně) byly dosazeny především u sloučenin s vyšším detekčním limitem, tj. hladina 0.1 ng/ml byla velmi blízko jejich detekčního limitu. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A.

Tabulka III: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření standardu 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Detekční limit přístroje (IDL)

Detekční limit přístroje (IDL) byl pro všechny analyty vypočten na základě osmi opakování nástřiku standardu 0.1 ng/ml. Výpočet IDL byl proveden s využitím softwaru MassHunter na základě standardního statistického zhodnocení naměřených dat dle vzorce uvedeného níže.

Výpočet detekčního limitu přístroje (IDL)

  • IDL je detekční limit přístroje
  • T je “t” hodnota Studentova rozdělení pro 99% interval spolehlivosti a n-1 stupňů volnosti
  • % RSD je relativní směrodatná odchylka z n opakování

Vypočtené detekční limity přístroje na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků jsou uvedeny v Tabulce IV. Pro látky, které nebylo možné na hladině 0.1 ng/ml detekovat, je v tabulce uvedeno N/A a jejich výpočet IDL byl proveden na základě měření standardu o koncentraci 1 ng/ml (viz Tabulka IV – sloupec s označením 1 ng/ml CSL 1 μl). Z výsledků je patrné, ze nejnižší IDL byl pro většinu sloučenin dosažen při použití nástřiku 1 μl v módu cold splitless. Při použití tohoto typu nástřiku se IDL pro všechny detekované sloučeniny pohyboval v intervalu 0.001-0.109 ng/ml. Nástřik 1 μl v cold splitless módu byl dále použit pro analýzu reálného vzorku potoční vody.

Tabulka IV: Přehled vypočtených IDL (ng/ml) na základě měření standardu o koncentraci 0.1 ng/ml při použití různých typů nástřiků. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné na dané koncentrační hladině detekovat.

Lineární dynamický rozsah

Linearita měření byla vyjádřena jako regresní koeficient (R2) vypočtený pro kalibrační křivku v oblasti od nejnižšího kalibračního bodu do 100 ng/ml. Pro všechny analyty se regresní koeficient pohyboval v intervalu 0.9965 - 0.9999. Ukázka kalibrační křivky pro hexachlorbenzen je uvedena na Obrázku 11. Ukázky chromatogramu nejnižších kalibračních bodů pro jednotlivé sloučeniny jsou uvedeny na obrázku v Příloze 3 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Obrázek 11: Ukázka kalibrační křivky – hexachlorbenzen, 0.005-100 ng/ml, 10 bodů, R2 = 0.9997

Měření vzorků potoční vody – opakovatelnost

Na základě předchozích měření roztoku standardu 0.1 ng/ml byl pro závěrečné měření reálného vzorku potoční vody vybrán nástřik o objemu 1 μl v módu cold splitless. V rámci měření reálných vzorků byl každý vzorek změřen desetkrát. Nejprve byl změřen přirozeně kontaminovaný vzorek potoční vody, který byl následně uměle kontaminován na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

U reálně kontaminovaného vzorku 5 se opakovatelnost (RSD, %) u detekovaných sloučenin pohybovala v intervalu 5.9-23.9%. Relativně vysokých RSD (%) bylo dosaženo z důvodu velmi nízkých koncentračních hladin, na kterých byl vzorek kontaminován, tj. zjištěné koncentrace byly velmi blízko detekčního limitu. Stejný trend lze pak sledovat i u uměle kontaminovaných vzorků. Vyšší hodnoty RSD (v Tabulce V označeny červeně) byly dosaženy především u sloučenin s vyššími detekčními limity. Pro látky, které nebylo možné v daném vzorku detekovat, je v tabulce uvedeno N/A. Ukázky chromatogramů reálně a uměle kontaminovaného vzorku potoční vody jsou uvedeny v Příloze 2 (kompletní zpráva jednotlivých výsledků dostupná na vyžádání na info@hpst.cz).

Tabulka V: Přehled opakovatelností (RSD, %) dosažených pro jednotlivé sloučeniny při měření reálně (Vzorek 5) a uměle kontaminovaného vzorku (SP1, SP2, SP3) potoční vody při nástřiků 1 μl v módu cold splitless; n=10. Pozn. N/A – sloučeninu nebylo možné v daném vzorku detekovat.

Závěr

Na základě výsledků získaných základním testováním výkonu nového GC/MS/MS systému Agilent Technologies 7010 Series lze reálně zhodnotit skutečné detekční limity pro vybrané analyty na základě získaných % RSD, které jsou, společně se skutečnými chromatografickými záznamy, nejvhodnějším způsobem objektivního zhodnocení reálných možností stroje. Konfigurace stroje využívající technologie pro vysokou robustnost a dlouhodobou stabilitu jako např. CFT - backflush modul ukazují, že tyto prvky patří k neoddělitelným součástem konfigurací především u instrumentů určených pro ultrastopovou analýzu ve složitých matricích.

Multimode/PTV injektor dále umožňuje v případě potřeby ještě výrazněji posunout detekční limity nástřikem většího objemu vzorku, a to běžně 4 – 8 nebo i 25 a více mikrolitrů v závislosti na typu matrice a potřebných detekčních limitech.

Výhodou vysoké citlivosti modelu 7010 Series a tedy možnosti nastřikovat menší objemy vzorků (především těch s komplikovanou matricí) přináší výrazně nižší kontaminaci systému, delší životnost spotřebního materiálu (linery, kolony), což snižuje celkové provozní náklady a výrazně snižuje také potřebu údržby a čištění především iontového zdroje samotného MS/MS detektoru.

V případě minimalizace manuální údržby celého systému a potřeby udržení maximálního výkonu MS/MS detektoru lze systém vybavit technologií SCIS (Self Cleaning Ion Source), která využívá reaktivity vodíku přidávaného do iontového zdroje ve velice malých množstvích, čímž udržuje iontový zdroj kontinuálně čistý, nebo aktivně v potřebných intervalech iontový zdroj čistí nezávisle na samotných analýzách.

HPST
 

Mohlo by Vás zajímat

Evaluation of Ultra High Resolution Mass Spectrometer in Targeted Forensic Screening Method for Urine Analysis in Comparison to Immunoassay and GC-MS Techniques

Postery
| N/A | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/SQ, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Forenzní analýza a toxikologie, Klinická analýza

Mass Spectrometry Applications for Environmental Analysis

Příručky
| 2014 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC/MSD, GC/MS/MS, Příprava vzorků, GC/SQ, GC/QQQ, HPLC, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap, LC/QQQ, IC-MS, IC/MS/MS, LC-SQ, LC/IT
Výrobce
Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí, Průmysl a chemie

Food Safety Applications NotebookEnvironmental Contaminants - Environmental Contaminants

Příručky
| 2012 | Thermo Fischer Scientific
Instrumentace
GC, Příprava vzorků, Spotřební materiál, Iontová chromatografie, LC kolony
Výrobce
Agilent Technologies, Thermo Fischer Scientific
Zaměření
Životní prostředí
 

Podobné články

Vědecký článek | Potraviny

STANOVENÍ AROMATICKÝCH ALKOHOLŮ V PIVU S VYUŽITÍM METODY EXTRAKCE NA PEVNÉ FÁZI (SPE) A DETEKCE POMOCÍ SPOJENÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (GC-MS) Část I. – Vypracování a validace vhodné analytické metody

V úvodní části jsou krátce shrnuty poznatky týkající se analytických postupů stanovení aromatických alkoholů a doplněny o stručnou literární rešerši věnovanou jejich vzniku, úloze a senzorickým účinkům v pivu.
Vědecký článek | Potraviny

Stanovení izomerů nižších mastných kyselin, senzoricky aktivních produktů stárnutí chmele, v pivu

Citlivá metoda založená na izolaci nižších mastných kyselin a jejich izomerů pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) a kvantitativním vyhodnocení pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS).
Další projekty
Sledujte nás
Další informace
WebinářeO násKontaktujte násPodmínky užití

LabRulez s.r.o. Všechna práva vyhrazena.