Extrakce na míchací tyčince – nová možnost při analýze některých senzoricky a aktivních látek v pivu

Ke stanovení senzoricky aktivních látek v pivu se používají analytické metody, které vyžadují úpravu vzorku. K tomu se využívají techniky založené na extrakci v systému kapalina-kapalina, extrakci na pevné fázi (SPE) nebo destilační postupy. V poslední době se stávají populárními mikroextrakční metody, jako např. mikroextrakce na pevné fázi (SPME) nebo extrakce na míchací tyčince (SBSE).

Tato práce se zabývá využitím extrakce na míchací tyčince při stanovení některých senzoricky aktivních látek v pivu. Použita byla míchací tyčinka (10 mm dlouhá, o průměru 1,3 mm) pokrytá polydimethylsiloxanem od firmy Gerstel GmbH, komerčně nazývaná Twister. Twister byl vložen přímo do vzorku piva a míchán. Poté byl Twister vyjmut, opláchnut destilovanou vodou a eluován 200 μl organického rozpouštědla. Nakonec byl získaný extrakt analyzován metodou plynové chromatografie. Práce obsahuje pracovní charakteristiky optimalizované metody.

1 ÚVOD

Je známo, že pivo obsahuje velké množství senzoricky aktivních látek. Jde o těkavé i netěkavé látky (bylo jich identifikováno přes 800), jejichž koncentrace ale nic neříká o významu této sloučeniny ve vztahu k senzorickým vlastnostem finálního výrobku. Teprve porovnání její koncentrace s koncentrací prahovou může dát požadovanou informaci (1). Překročení prahové hodnoty jedné nebo více látek běžně se vyskytujících pod prahovou hodnotou se může projevit jako senzorická závada. Ale i příliš nízká koncentrace některé ze základních chuťových složek nebo i úplná absence této látky může negativně ovlivňovat výslednou chuť a vůni piva (2). Je pochopitelné, že celkový senzorický profil piva se kromě ceny a obalu rozhodujícím způsobem podílí na úspěchu piva na trhu. Důležitá je také stálost tohoto profilu, kdy zákazník nesmí být zklamán koupí téhož výrobku po určité době.

Z těchto důvodů se věnuje pozornost analytickému stanovení obsahu některých významných skupin senzoricky aktivních látek. Jednou z nich jsou estery, jejichž převážná část se tvoří při hlavním kvašení a většinou se vyznačují příjemnou vůní připomínající některé druhy ovoce. Podle Arkima a Jounela-Erikssona se estery podílejí na celkovém arómatu piva asi jednou pětinou (3).

K analytickému stanovení senzoricky aktivních látek se používají hlavně metody plynové chromatografie. K přípravě vzorku se využívají klasické postupy jako headspace technika, prekoncentrační metody purge-and-trap, destilační postupy, extrakce v systému kapalinakapalina nebo extrakce na pevné fázi (4–9). Vhodnou alternativou ke klasické headspace technice výrazným způsobem snižující pořizovací náklady je mikroextrakce na pevné fázi (SPME). Koncept této techniky byl navržen v prvé polovině devadesátých let Januszem Pawliszynem na University of Waterloo (Ontario, Kanada). Jde o sorpčně-desorpční techniku. Její princip spočívá v nanesení malého množství sorbentu na vlákno z křemenného skla. Vlákno se ponoří do vzorku nebo do plynné fáze nad vzorkem. Po ustanovení rovnováhy se vlákno vytáhne ze vzorkované matrice a vloží se do nástřikového prostoru plynového chromatografu. Látky zachycené na sorbentu tepelně desorbují a jsou unášeny nosným plynem na kolonu chromatografu, kde dochází k jejich separaci. Při průchodu septy vzorkovnice a chromatografu se vlákno zatáhne do jehly, která je chrání proti mechanickému poškození. Při vzorkování a chromatografické analýze je vlákno z jehly vysunuto. Jde o rychlou, jednoduchou metodu nevyžadující jakéhokoli použití rozpouštědla (10, 11, 12).
V pivu byly SPME metodou stanoveny některé alkoholy, estery, dimethylsulfid, vicinální diketony, mastné kyseliny nebo karbonylové látky (13, 14, 15, 16, 17, 18).

Dalším rozvojem mikroextrakčních metod využívajících jako extrakční médium polydimethylsiloxanovou fázi se zabýval Baltussen a kol. (19). Na základě tohoto výzkumu představil novou extrakční techniku – extrakci na míchací tyčince (SBSE z anglického stir bar sorptive extraction).Tato technika je založena na stejných principech jako mikroextrakce na pevné fázi, ale tím, že je použito podstatně větší množství polydimethylsiloxanové fáze (50–300 μl), dochází k výrazně většímu obohacení organických sloučenin z extrahované matrice a v důsledku toho vzrůstá citlivost 100 až 1000krát.

V praxi je tedy magnetická tyčinka zatavena do skla, sklo je deaktivováno a pokryto polydimethylsiloxanovou fází. Výrobu si vzala pod svá křídla firma Gerstel, a prodává je pod názvem Twister. K dispozici jsou různé druhy Twisterů – délka 10 mm s tloušťkou fáze 0,5 mm nebo 1,0 mm, dále v délce 40 mm opět s tloušťkou fáze buď 0,5 mm nebo 1,0 mm. Ve všech případech je vnější průměr míchací tyčinky 3,2 mm.Twister o délce 10 mm se obvykle používá pro extrakci z objemu 1–50 ml, o délce 40 mm pro extrakci z objemů 100–250 ml (20).

Extrakce probíhá velmi jednoduše.Twister se vloží přímo do vzorku a nechá se míchat po dobu 30–120 min. Během této doby dochází k rozdělení analytů mezi matricí a polydimethylsiloxanovou fází Twisteru podle jejich rozdělovacích koeficientů. Potom je Twister vložen do termálního desorbéru, kde dojde k termální desorpci analytů (obvykle při teplotě 150–300 °C) a ty jsou pak bezprostředně separovány na plynovém chromatografu (20).

Pro stanovení velmi těkavých látek je možné využít headspace sorpční extrakci (HSSE). Tato technika, při které dochází k zakoncentrování analytů, je mnohem citlivější než klasická headspace metoda. Twister se vloží do speciálního držáčku a vše se umístí do uzavřené headspace vialky. Twister se tak nachází v parním prostoru nad vzorkem a analyty jsou extrahovány a zkoncentrovány v polydimethylsiloxanové fázi Twisteru (21).

V pivovarské analytice bylo techniky SBSE použito pro stanovení letinkové neboli sluneční příchutě (3-methyl-2-buten-1-thiol) a dalších sirných látek (22), hořkých kyselin v pivu metodou HPLC (23), karbonylových sloučenin (24).

Cílem této práce bylo vyzkoušet extrakci některých senzoricky aktivních látek z piva pomocí techniky extrakce na míchací tyčince. Po extrakci byly látky následovně zpětně extrahovány z polydimethylsiloxanové fáze do organického rozpouštědla a analyzovány na plynovém chromatografu s plamenoionizačním detektorem.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie, standardy

Ethanol – Lach-Ner, s. r. o., ČR; methanol, hexan, dichlormethan – Merck, Německo; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a synteproduct tický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.

Octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý, kaprylan ethylnatý, octan fenylnatý, kaprinan ethylnatý, octan fenylethylnatý, lauran ethylnatý, myristan ethylnatý, palmitan ethylnatý – Sigma-Aldrich, USA.

2.2 Materiál a přístroje

Twister o délce 10 mm, vnějším průměru 3,2 mm a tloušťce polydimethylsiloxanové fáze 0,5 mm – Gerstel, Německo; 20 ml headspace vialky, 2 ml šroubovací vialky, 350 μl skleněné inserty, PTFE silikonová septa, víčka, uzavírací a otevírací kleště – CRS, USA; magnetické míchadlo – MLW RH3, Polsko; pinzeta – Chirana, ČR; plynový chromatograf CP 9001 – Chrompack, Holandsko; automatický dávkovač vzorků ASG 40 – Labio, ČR.

2.3 Příprava vzorku

Před první aplikací a každým dalším použitím byl Twister kondicionován po dobu 1 h při teplotě 300 °C v atmosféře helia při průtoku 50 ml/min. Po vychladnutí na laboratorní teplotu byl Twister připraven pro další extrakci.

Zakoupené vzorky piv byly přechovávány v chladničce při teplotě 4 °C až do doby analýzy.Všechny pokusy vedoucí k optimalizaci podmínek stanovení a pro proměření kalibračních křivek byly prováděny na modelovém roztoku 5% obj. ethanolu ve vodě.

Do 20 ml headspace vialky bylo napipetováno 10 ml vzorku a do vzorku byl vložen Twister. Vialka byla uzavřena septem krytým hliníkovou folií a umístěna na magnetické míchadlo, kde byl vzorek míchán při 1200 min-1 za laboratorní teploty. Po skončení extrakce byl Twister opatrně pinzetou vyndán, krátce opláchnut redestilovanou vodou a osušen. Pro zpětnou extrakci analytů z polydimethylsiloxanové fáze byl Twister vložen do 350 μl skleněného insertu s 200 μl organického rozpouštědla. Tento insert byl umístěn do šroubovací vialky o objemu 2 ml a na magnetickém míchadle míchán při 1200 min-1. Po skončení extrakce z Twisteru byly 2 μl eluátu nastříknuty na kapilární kolonu plynového chromatografu.

2.4 Podmínky plynové chromatografie

Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Chrompack CP 9001, který byl opatřen automatickým dávkovačem vzorků Labio ASG 40.K separaci analytů byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona ZB-WAX firmy Phenomenex s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperovaná na teplotu 80 °C po dobu 1 min, poté následoval teplotní gradient 8 °C/min do teploty 240 °C.Při této teplotě kolona zůstala po dobu 3 min.K nástřiku byl použit split/splitless injektor v režimu splitless. Split ventil byl otevřen po uplynutí 0,25 min. Injektor byl vyhříván na teplotu 260 °C, plamenoionizační detektor na teplotu 270 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 150 kPa při teplotě 80 °C.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

3.1 Optimalizace metody

Nejprve byl zkoumán vliv různých rozpouštědel na desorpci analytů z polydimethylsiloxanové fáze Twisteru. Byla odzkoušena tři různá rozpouštědla dichlormethan, směs dichlormethan:methanol v poměru 90:10 a dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Jak vyplývá z obr. 1, součet ploch píků chromatografického záznamu všech stanovovaných látek byl největší pro směs dichlormethan: methanol v poměru 90:10. V této směsi rozpouštědel dosahovaly velkých odezev vyjádřených v plochách píků především těkavější sloučeniny jako octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý a kaprylan ethylnatý, a to až o 36 % více než tytéž estery v druhém nejúčinnějším rozpouštědle dichlormethan:hexan v poměru 50:50. Zato méně těkavé analyty jako myristan ethylnatý a palmitan ethylnatý vykázaly větší odezvy v plochách píků o 10 % v rozpouštědle dichlormethan:hexan v poměru 50:50 na rozdíl od směsi dichlormethan: methanol v poměru 90:10. Vzhledem k tomu, že se tyto méně těkavé látky vyskytují v pivu v řádově nižších koncentracích než např. octan isoamylnatý, byla k dalším pokusům použita směs dichlormethan:hexan v poměru 50:50.

Obr. 1 Vliv různých rozpouštědel na celkovou odezvu esterů při jejich desorpci z polydimethylsiloxanové fáze Twisteru (A – dichlormethan, B – dichlormethan:methanol 90:10, C – dichlormethan:hexan 50:50)

Dále byl zjišťován vliv doby extrakce na velikost ploch píků stanovovaných látek. Jak ukazuje obr. 2, odezva sloučenin se podle očekávání zvětšovala s prodlužující se dobou extrakce.Těkavé látky, jako např. octan isoamylnatý, dosáhly saturace již po 45 min extrakce, delší doba extrakce, jako např. 120 min, znamenala pro tuto sloučeninu vzrůst odezvy jen o 1 %. Naproti tomu odezva palmitanu ethylnatého po 120 min extrakce se zvýšila o 42 % v porovnání s extrakcí trvající 60 min. Výše vroucí látky zřejmě pomaleji přecházejí do polydimethylsiloxanové fáze a potřebují tak delší čas k ustanovení rovnováhy. V praxi ale pro přesné stanovení není nezbytně nutné dosáhnout úplného rovnovážného stavu pro všechny stanovované sloučeniny. Na druhé straně, pokud by se extrahovalo pouze relativně krátkou dobu, nejen že by se snížila citlivost metody, ale také by se zhoršila opakovatelnost. Proto byla pro další experimenty zvolena extrakční doba 60 min.

Obr. 2 Závislost délky doby vzorkování na extrakci některých esterů sorbovaných na Twister

Vliv doby, po kterou byla prováděna zpětná extrakce stanovovaných látek z polydimethylsiloxanové vrstvy Twisteru do rozpouštědla, na celkovou velikost ploch píků všech sloučenin je zřejmý z obr. 3. Zpětná extrakce látek je zřejmě úplná již po 40 min.Ve srovnání s 20 min extrakce vzrostla při 40 min extrahování odezva octanu isoamylnatého o 28 %, odezva myristanu ethylnatého o 47 %. Naproti tomu vzrůst plochy píků při reextrakci trvající 60 min ve srovnání s dobou 40 min představoval jen 3 % pro octan isoamylnatý, pro lauran, myristan a palmitan ethylnatý byla velikost ploch píků dokonce < 1 %. Proto v dalších pokusech byla prováděna zpětná extrakce po dobu 40 min.

Obr. 3 Vliv délky doby, po kterou se provádí zpětná extrakce analytů z Twisteru do rozpouštědla, na velikost odezvy stanovovaných esterů

Chromatografický záznam vzorku piva po sorpční extrakci na míchací tyčince je uveden na obr. 4. Je z něj patrná vyhovující separace všech stanovovaných látek prostá všech interferencí. Byly také provedeny analýzy extraktu z Twisteru po jeho rekondicionaci. Takto získané chromatografické záznamy nevykazovaly přítomnost žádné ze sledovaných analytů, a tak bylo potvrzeno, že výše popsaný postup rekondicionace Twisteru je dostačující.

Obr. 4 Chromatogram piva po sorpční extrakci na míchací tyčince. 1 – octan isoamylnatý, 2 – kapronan ethylnatý, 3 – kaprylan ethylnatý, 4 – octan fenylnatý, 5 – kaprinan ethylnatý, 6 – octan fenylethylnatý, 7 – lauran ethylnatý, 8 – myristan ethylnatý, 9 – palmitan ethylnatý

3.2 Validace metody

Pro všechny stanovované sloučeniny byly proměřeny devítibodové kalibrační křivky v rozsahu koncentrací 0,015 mg/l až 30 mg/l v 5% obj. roztoku ethanolu. Výsledky jsou uvedeny v tab. 1. Lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty při lineární regresi byly lepší než 0,9988, při kvadratické lepší než 0,9995.

Tab. 1 Pracovní charakteristiky metody stanovení některých esterů po extrakci technikou sorpční extrakce na míchací tyčince

Další pracovní charakteristiky metody jsou shrnuty v tab. 1. Správnost metody byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah stanovovaných esterů v pěti komerčních vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem sledovaných analytů na koncentrační hladině 7,5 mg/l. Výtěžnosti se pohybovaly od 78–107 %. Opakovatelnost metody byla zjištěna opakovanou sorpční extrakcí na míchací tyčince jednoho a téhož vzorku piva (pětkrát během jednoho dne). Relativní směrodatné odchylky se nacházely v intervalu 2,1–7,3 %.

4 ZÁVĚR

Bylo dokázáno, že pro stanovení některých, především méně těkavých esterů (octan isoamylnatý, kapronan ethylnatý, kaprylan ethylnatý, octan fenylnatý, kaprinan ethylnatý, octan fenylethylnatý, lauran ethylnatý, myristan ethylnatý a palmitan ethylnatý) v pivu majících vliv na senzorickou kvalitu výrobku je sorpční extrakce na míchací tyčince následovaná zpětnou extrakcí analytů z polydimethylsiloxanové fáze do organického rozpouštědla velmi vhodnou alternativou ke klasickým technikám jako je destilace s vodní párou následovaná extrakcí v systému kapalina-kapalina nebo SPE a SPME. Pro stanovení esterů v pivu tímto postupem byly na základě provedených experimentů navrženy tyto pracovní podmínky: 10 ml vzorku extrahovat Twisterem (délka 10 mm, tloušťka polydimethylsiloxanové fáze 0,5 mm) při 1200 ot/min po dobu 1 h, zpětnou extrakci analytů z Twisteru provést v 200 μl směsi rozpouštědel dichlormethan:hexan v poměru 50:50 při 1200 ot/min po dobu 40 min.

V porovnání s postupy využívajícími sorpční extrakce na míchací tyčince v kombinaci s termální desorpcí odpadá při zpětné extrakci do rozpouštědla nutnost pořídit finančně velmi náročný termální desorbér. Popsaná metoda je tedy levná, jednoduchá, používá malé množství vzorku, pouze mikrolitry organického rozpouštědla a vyznačuje se příznivými pracovními charakteristikami.