Stanovení mastných kyselin v pivu technikou SPME

Vzhledem k tomu, že vysoký obsah mastných kyselin v kvasném médiu může nepříznivě ovlivnit výslednou kvalitu piva, je nutné mít k dispozici vhodnou analytickou metodu k spolehlivému určení jejich obsahu v pivu nebo v mladině.

Předkládaná práce popisuje rychlou a jednoduchou možnost selektivního stanovení volných mastných kyselin (C₆–C₁₂) v pivu nebo mladině použitím mikroextrakce na pevné fázi (SPME) a plynové chromatografie. Volné mastné kyseliny C₆–C₁₂ byly extrahovány SPME vláknem umístěným v headspace prostoru vialky obsahující vzorek piva s přídavkem soli. Z SPME vlákna byly analyty uvolněny termální desorpcí ve vyhřátém injektoru plynového chromatografu vybaveného křemennou kapilární kolonou SPB-1000 a plamenoionizačním detektorem. Pro lepší kvantifikaci bylo použito kyseliny heptanové a kyseliny undekanové jako vnitřních standardů.V práci jsou dále popsány pracovní charakteristiky optimalizované metody.

Tato metoda je časově nenáročná, levná, nepoužívá žádná rozpouštědla a vyznačuje se vysokou citlivostí a opakovatelností. Je možné ji doporučit pro běžné kontrolní analýzy v pivovarských laboratořích.

1 ÚVOD

Množství volných mastných kyselin v pivu je dáno nejenom jejich obsahem v surovinách, ale především jejich vznikem při kvašení a zrání piva. Zvýšená koncentrace mastných kyselin v kvasném médiu může negativně ovlivnit vitalitu kvasinek, senzorické vlastnosti a dále např. i stabilitu pěny hotového piva.

K analytickému stanovení volných mastných kyselin se běžně používá plynová chromatografie. Před vlastní analýzou je však nutné mastné kyseliny z piva vyextrahovat a zakoncentrovat. K tomu je využívána extrakce v systému kapalina-kapalina nebo adsorpce na sorbentu s následnou elucí analytů. Při extrakci kapalina-kapalina je nutné použít velké množství drahých a zdraví nebezpečných rozpouštědel jako je chloroform (1), směs chloroformu a ethanolu (2), dichlormethan (3) a směs ethylacetátu a n-pentanu (4). Tento především časově náročný postup lze úspěšně nahradit moderními metodami – extrakcí na pevné fázi (SPE). Nejčastěji jsou používány kolonky naplněné vázanou fází C18 (5, 6). Výhodou těchto technik je rychlost, minimalizace množství použitých organických rozpouštědel a z hlediska dosažených výsledků dobrá výtěžnost a vysoká reprodukovatelnost.

Další možností je využití metody mikroextrakce na pevné fázi (SPME).Tato nová technika představuje rychlý a jednoduchý způsob přípravy vzorků bez použití jakéhokoli extrakčního rozpouštědla (7, 8). SPME metoda byla již úspěšně použita při stanovení různých senzoricky aktivních látek v nápojích (9, 10, 11, 12).

Práce se zabývá nalezením vhodných SPME podmínek, jako je například účinek vysolovacího efektu síranu amonného, doba extrakce a vliv koncentrace ethanolu na extrakci volných mastných kyselin (C₆–C₁₂) z piva a mladiny. Dále jsou uvedeny dosažené pracovní charakteristiky optimalizované metody. Pozornost je věnována také vlastnímu analytickému stanovení na plynovém chromatografu s plamenoionizačním detektorem.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie, standardy

Ethanol, síran amonný – Lach-Ner, s. r. o., ČR; helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0 a syntetický vzduch – Messer, ČR; ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore, USA.

Kyselina hexanová (kapronová), heptanová, oktanová (kaprylová), nonanová (pelargonová), dekanová (kaprinová), undekanová a dodekanová (laurová) – Supelco, USA.

2.2 Příprava vzorku a podmínky headspace SPME

Vzorky zakoupeného piva byly před analýzou vychlazeny na 4 °C. Všechny pokusy vedoucí k optimalizaci podmínek stanovení a pro proměření kalibračních křivek byly prováděny na modelovém roztoku 5 % obj. ethanolu ve vodě. Experimenty byly prováděny v headspace uspořádání SPME. Extrakce byla prováděna v headspace prostoru nad 4 ml vzorku obohaceného přídavkem kyseliny heptanové a undekanové, které byly využity jako vnitřní standardy (výsledná koncentrace každé kyseliny byla 1,3 mg/l), ve skleněné vialce o objemu 20 ml uzavřené septem krytým hliníkovou fólií. Před zahájením SPME extrakce byla vialka se vzorkem intenzivně třepána po dobu 10 s.

2.3 Podmínky plynové chromatografie

Vlastní stanovení probíhalo na plynovém chromatografu Carlo Erba 5300 Mega Series. Analyty byly termálně desorbovány z SPME vlákna opatřeného fází 65 μm Carbowax-Divinylbenzen ve vyhřátém prostoru injektoru plynového chromatografu. K separaci byla použita 30 m dlouhá křemenná kapilární kolona SPB-1000 firmy Supelco s vnitřním průměrem 0,32 mm a tloušťkou filmu 0,25 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. SPME vlákno bylo ponecháno v injektoru po dobu 5 min, a tak zároveň došlo k jeho kondicionaci pro další analýzu. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po dobu 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 100 kPa při 75 °C.

3 OPTIMALIZACE METODY

Posunutí fázové rovnováhy ve prospěch plynné fáze lze docílit přídavkem solí anorganických kyselin. Z tohoto důvodu byl testován vysolovací účinek síranu amonného na extrakci volných mastných kyselin, a to v koncentračním rozsahu 0–4 g soli ve 4 ml vzorku.

Z obr. 1 je patrné, že vysolovací efekt se zde očividně uplatňuje. Pro kyseliny C₁₀–C₁₂ bylo maximální odezvy dosaženo již po přídavku 2 g soli, ale pro kyseliny C₆–C₉ až po přídavku 4 g síranu amonného (data nejsou uvedena). Poměry odezvy jednotlivých kyselin C₆–C₉ k odezvě kyseliny C₇ (vnitřní standard) a poměry odezvy jednotlivých kyselin C₁₀–C₁₂ k odezvě kyseliny C₁₁ (vnitřní standard) byly relativně stálé.Variační koeficienty ve všech případech ležely v rozsahu 4,3–7,8 %. Z toho vyplývá, že poměry odezvy dané mastné kyseliny a vnitřního standardu jsou konstantní bez ohledu na význam vysolovacího efektu.

Obr. 1 Vliv přídavku soli (síranu amonného) na celkovou odezvu volných mastných kyselin

Vliv délky doby vzorkování na extrakci mastných kyselin je zřejmý z obr. 2. Odezva detektoru vzrůstala až do doby 30 min, přičemž hodnoty poměrů odezvy každé mastné kyseliny k odezvě vnitřních standardů kyselin C₇ nebo C₁₁ zůstávaly konstantní během všech různých dob extrakce. Variační koeficienty se nacházely v rozsahu 2,5–6,9 %.

Obr. 2 Vliv délky doby vzorkování na extrakci volných mastných kyselin

Obr. 3 dokládá vliv různého obsahu ethanolu na extrakci volných mastných kyselin. Se vzrůstající koncentrací ethanolu sice odezva látek klesá, ale poměry odezev jednotlivých mastných kyselin k odezvě vnitřních standardů kyselin C₇ nebo C₁₁ zůstávaly neměnné a variační koeficienty vykazovaly hodnoty 2,1–7,5 %.

Obr. 3 Vliv různého obsahu ethanolu na extrakci volných mastných kyselin

Chromatografický záznam reálného vzorku piva je uveden na obr. 4. Je z něj patrná vyhovující separace všech stanovovaných mastných kyselin a vnitřních standardů prostá všech interferencí.

Obr. 4 Chromatogram piva. 1 – kapronová kyselina, 2 – heptanová kyselina (vnitřní standard), 3 – kaprylová kyselina, 4 – nonanová kyselina, 5 – kaprinová kyselina, 6 – undekanová kyselina (vnitřní standard), 7 – laurová kyselina

4 VALIDACE METODY

Pro všechny stanovované volné mastné kyseliny byla proměřena kalibrační křivka v rozsahu koncentrací 0,0015 mg/l až 8 mg/l v 5 % obj. roztoku ethanolu. Lepší shody bylo dosaženo proložením jednotlivých kalibračních bodů kvadratickou křivkou namísto lineární regrese. Korelační koeficienty všech mastných kyselin při použití lineární regrese ležely v rozmezí 0,9931–0,9989, zatímco při aplikaci kvadratické křivky jejich rozsah byl od 0,9956 do 0,9993.

Validační parametry jsou shrnuty v tab. 1. Správnost metody byla ověřena pomocí výtěžnosti. Nejprve byl změřen přirozený obsah volných mastných kyselin v sedmi reálných vzorcích piv. Poté byly tytéž vzorky piv obohaceny přídavkem mastných kyselin na koncentrační hladině 2 mg/l každé látky. Opakovatelnost metody byla zjištěna opakovanou headspace SPME analýzou jednoho a téhož vzorku piva (sedmkrát během jednoho dne).

Tab. 1 Výtěžnost a opakovatelnost headspace SPME metody stanovení volných mastných kyselin (CV – variační koeficient)

Výsledky dokazují, že metoda se vyznačuje dobrou opakovatelností a že koncentrace volných mastných kyselin jsou stanoveny správně.

5 ZÁVĚR

Bylo dokázáno, že i když jsou odezvy volných mastných kyselin ovlivňovány přídavkem soli, dobou vzorkování a obsahem ethanolu, poměry odezev kyseliny kapronové, kaprylové a nonanové k odezvě kyseliny heptanové jako vnitřnímu standardu a kyseliny kaprinové a laurové k odezvě kyseliny undekanové jako vnitřnímu standardu zůstávají konstantní bez ohledu na jakékoliv změny ve výše uvedených podmínkách. Pro stanovení volných mastných kyselin v pivu nebo mladině headspace SPME metodou byly na základě provedených experimentů navrženy tyto podmínky: 4 ml vzorku obohaceného přídavkem vnitřních standardů kyseliny heptanové a undekanové (výsledná koncentrace každé látky činila 1,3 mg/l vzorku) a 4 g síranu amonného, protřepat v ruce po dobu 10 s. Poté následuje extrakce za laboratorní teploty po dobu 30 min SPME vláknem pokrytém fází 65 μm Carbowax-Divinylbenzen, umístěném v headspace prostoru vialky.

Tato metoda je časově i finančně nenáročná, nepoužívá žádná rozpouštědla a vyznačuje se vysokou citlivostí a opakovatelností. Uvedenou metodu je možné doporučit pro potřeby běžných kontrolních analýz v pivovarských laboratořích.