Průzkum obsahu benzenu v nealkoholických nápojích

Již téměř 20 let je známo, že pokud jsou nealkoholické nápoje konzervovány kyselinou benzoovou, může tato kyselina reagovat s kyselinou askorbovou za vzniku karcinogenního benzenu. Zjištěné koncentrace benzenu ve 49 nealkoholických nápojích zakoupených v české tžní síti, analyzovaných v rámci pětiletého průzkumu, byly vždy nižší než 10 μg∙l⁻¹; průměrný obsah benzenu byl okolo 1 μg∙l⁻¹. Studie ukázala, že obsah benzenu není snadné předvídat. Ze sledovaných složek nápoje (benzoát, askorbová kyselina, sladidla, minerály, CO2) byla prokázána významná pozitivní korelace pouze mezi obsahem benzenu a benzoátu. Zdá se, že více než složení ovlivňují pozitivní nálezy benzenu v nápojích vnější kontaminace surovin a podmínky skladování.

1 ÚVOD

Od roku 1991 je známo, že pokud jsou nealkoholické nápoje konzervovány benzoovou kyselinou (benzoát sodný), reaguje tato látka za určitých podmínek s askorbovou kyselinou (vitamin C) nebo erythorbovou kyselinou (isomer vitaminu C) za vzniku karcinogenního benzenu (Nyman et al., 2008).

Askorbová kyselina interaguje s benzoovou kyselinou v přítomnosti přechodných kovů, tj. s Cu (II) a Fe (III) ionty, podle následujícího mechanismu: O2 může být redukován pomocí askorbové kyseliny na superoxidový anion radikál, z něhož spontánně vzniká peroxid vodíku (H₂O₂); následně může askorbová kyselina redukovat peroxid vodíku za tvorby hydroxylového radikálu způsobujícího dekarboxylaci benzoátu sodného na benzen. Vznik benzenu je primárně ovlivňován pH, UV zářením a teplotou (Lachenmeier et al., 2008; Gardner a Lawrence, 1993; Adams, 1997). Naopak sladidla, např. cukr, fruktosovo-kukuřičný nebo škrobový sirup, a chelatační činidla mohou reakci inhibovat. Tvorba benzenu v nealkoholických nápojích tedy závisí na složení výrobku a podmínkách skladování (ICBA, 2006). V roce 1987 byl benzen klasifikován jako lidský karcinogen (skupina 1) (Gardner a Lawrence, 1993; IARC, 1987). Většina z denního příjmu benzenu pochází z ovzduší buď z přírodních zdrojů (lesní požáry, prosakování nafty), nebo z lidské činnosti, jako je kouření nebo výfukové plyny (Wallace et al., 1993).

Denní expozice benzenem pro nekuřáky je stanovena na 200 až 450 μg∙den⁻¹ (WHO, 1996). Do potravin se benzen může dostat prostřednictvím následujících zdrojů: obalový materiál, skladovací prostředí, znečištění vodních zdrojů, kontaminovaný CO₂ používaný pro sycení, rozklad nebo reakce konzervačních látek, postupy vaření a ozařovací techniky využívané pro sterilaci (Ridgway et al., 2007; Fabietti et al., 2001).

Obsah benzenu v potravinách a nápojích byl již stanovován v rámci řady studií. Nejvyšší koncentrace byly nalezeny v jamajském rumu (120 μg∙l⁻¹), ozářeném hovězím mase (19 μg∙kg⁻¹), vejcích (500–1 900 μg∙kg⁻¹), ústřicích (220–260 μg∙kg⁻¹) a rybách (3–88 μg∙kg⁻¹) (Wallace et al., 1993; WHO, 1993; U.S. HHS, 1997; U.S. HHS, 2011).

Byly stanoveny následující maximální limity pro benzen jako kontaminant pitné vody: 1.0 μg∙l⁻¹ (Evropská unie) a 10 μg∙l⁻¹ (Světová zdravotnická organizace). Nicméně, doposud nebyl určen zákonný limit pro benzen v potravinářských výrobcích a nápojích (nealkoholických nápojích) (WHO, 1996; EC, 1998).

V letech 2005–2007 byly provedeny dva velké průzkumy (Spojené státy americké), v rámci nichž bylo analyzováno téměř 200 vzorků nealkoholických nápojů (tab. 1) (U.S. FDA, 2007). U většiny vzorků byly koncentrace benzenu stanoveny nižší než 1 μg∙l⁻¹ nebo pod mezí detekce; 93 % vzorků obsahovalo benzen v koncentracích nižších než 10 μg∙l⁻¹.

Tab. 1 Data k obsahu benzenu v nealkoholických nápojích (výzkum Amerického úřadu pro kontrolu potravin a léčiv v období od listopadu 2005 do 20. dubna 2006 a od 21. dubna 2006 do 16. května 2007); n = počet výrobků; n.d. = nedetekováno; *místo kyseliny askrobové může obsahovat jiné deriváty jako jsou kyselina erythorbová nebo askorbát

V roce 2008 bylo analyzováno téměř 450 vzorků nealkoholických nápojů v rámci dalších dvou rozsáhlých studií (Belgie a Německo); pro většinu vzorků se koncentrace benzenu pohybovala pod limitem 1 μg∙l⁻¹ nebo pod mezí detekce a pouze v 0,4 % (2 případy) byla stanovena nad 10 μg∙l⁻¹ (Lachenmeier et al., 2008; Poucke et al., 2008).

Od roku 2010 nebyly provedeny žádné velké průzkumy zaměřené na nealkoholické nápoje. K dispozici jsou po roce 2010 pouze data ze studie provedené v roce 2012, která byla zaměřena na analýzu potravin a nápojů na belgickém trhu; bylo analyzováno 52 vzorků nealkoholických nápojů a zjištěné koncentrace benzenu byly v rozmezí od nedetekováno do 11,5 μg∙l⁻¹ (Vinci et al., 2012). Žádná z výše uvedených prací nezahrnovala vzorky z České republiky nebo střední a východní Evropy.

V naší studii jsme se zaměřili na trendy v posledních letech, týkající se změny receptury produktu z hlediska koncentrace prekurzorů benzenu a vyhodnocení faktorů potlačujících a podporujících vznik benzenu v nealkoholických nápojích českého původu.

2 MATERIÁL A METODY

2.1 Chemikálie

Benzen (p.a., Penta), benzen-d6 (2 000 μg∙ml⁻¹ v methanolu, Sigma-Aldrich, Německo), methanol, benzoát sodný standard a askorbová kyselina (p.a., Sigma-Aldrich, Německo), kyselina sírová (p.a., Lachner), L-cystein a šťavelová kyselina (p.a., Sigma-Aldrich, Německo) byly zakoupeny komerčně.

2.2 Vzorky

Bylo analyzováno dvacet tři vzorků nealkoholických nápojů v roce 2006 (tab. 2) a dvacet šest vzorků nealkoholických nápojů v roce 2011 (tab. 3). Všechny z nich pocházely z obchodní sítě v Praze a byly vyrobeny různými společnostmi. Vzorky byly skladovány při teplotě 6 °C. Všechny nápoje byly analyzovány v první čtvrtině garantované doby trvanlivosti.

Tab.2 Přehled vzorků, 2006 (přítomnost benzoátu sodného, kyseliny askorbové a ovocného podílu uvedených na etiketě analyzovaných nelakoholických nápojů); × znamená deklarovanou přítomnost benzoátu sodného a askorbové kyseliny; – znamená nedeklarováno

Tab. 3 Přehled vzorků, 2011 (přítomnost benzoátu sodného, askorbové kyseliny a ovocného podílu uvedených na etiketě analyzovaných nelakoholických nápojů); × znamená deklarovanou přítomnost benzoátu sodného a askorbové kyseliny; – znamená nedeklarováno

Skladovací experiment byl proveden pro jeden z výše uvedených výrobků (složení: minerální voda, cukr, aroma, citronová kyselina, benzoát sodný, dimethyldikarbonát, askorbová kyselina): neotevřené komerční lahve ze tří šarží nealkoholického nápoje byly udržovány při pokojové teplotě (20 ± 1 °C) za viditelného světla (přibližně 10 h∙d⁻¹) po dobu šesti měsíců.

2.3 Stanovení benzenu

K mikroextrakci tuhou fází (SPME) bylo využito 50/30 μm DVB/ CAR/PDMS vlákno (Supelco Inc., Belefonte, USA). Obsah benzenu byl stanoven pomocí GC 6890N s kvadrupólovým hmotnostním detektorem MS 5973 (Agilent Technologies, USA) a DB-5MS kolonou (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm; Agilent JW Scientific, USA).

Zásobní standardy benzenu a benzenu-d6 (oba 0,002 g∙l⁻¹) byly připraveny v methanolu. Sycené vzorky byly před analýzou odplyněny po dobu 1,5 min v ultrazvukové lázni. 5 ml z každého vzorku bylo převedeno do 10 ml vialky, do každé z nich byl přidán vnitřní standard benzen-d6 (5 μl zásobního roztoku). Vzorky byly temperovány 10 min při teplotě 60 °C; pro vlastní extrakci bylo vlákno vsunuto do headspace prostoru vialky a vzorek byl míchán při 500 rpm po dobu 5 min při teplotě 60 °C.

Separační chromatografické podmínky byly následující: počáteční teplota kolony 45 °C (5 min), nárůst teploty na 200 °C rychlostí 25 °C∙min⁻¹ (1 min). Teplota injektoru byla nastavena na 200 °C (dělicí poměr 30:1), iontový zdroj a MS kvadrupól na teplotu 230 °C a 150 °C; desorpce po dobu 5 min, konstantní průtok He 0,7 ml min-1. Pro detekci benzenu byl využit SIM mód (m/z 78, 77 pro benzen a 84, 82 pro benzen-d₆).

2.4 Stanovení benzoové kyseliny (jako benzoátu sodného) a askorbové kyseliny (askorbové a dehydroaskorbové)

Pro stanovení benzoové kyseliny byly vzorky zředěny destilovanou vodou, filtrovány a následně nastříknuty (20 μl) do HPLC. Teplota kolony (Rezex RFQ-Fast Fruit H + (8%, 100 x 7,8 mm, 8 μm, Phenomenex, Chromservis, ČR) byla udržována na 50 °C. Mobilní fáze se skládala z kyseliny sírové (0,05 mol∙l⁻¹) v methanolu (10%), přičemž průtok byl 1 ml∙min⁻¹. Detekce probíhala při 233 nm.

Askorbová kyselina byla stanovena po zředění vzorku destilovanou vodou s L-cysteinem (0,1%) a šťavelovou kyselinou (1% ) pomocí HPLC podle Rajchl et al. (2010).

Obě HPLC analýzy byly provedeny na sestavě Dionex HPLC/UV/VIS (AMEDIS, ČR).

2.5 Statistická analýza

Pro každý vzorek byly provedeny 3 stanovení a byly uvedeny průměrné hodnoty; pro vyhodnocení byly použity programy Statistica 8.0 (StatSoft ČR s.r.o., Praha, ČR) a Excel 2010 (Microsoft Corporation).

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

3.1 Validace metody

Pro benzen bylo posuzováno pět validačních parametrů: relativní směrodatná odchylka měření (opakovatelnost) byla 6,3 %, linearita byla 1,0–50 μg∙l⁻¹, mez detekce (LOD) byla 0,1 μg∙l⁻¹ a mez kvantifikace (LOQ) 1,0 μg∙l⁻¹. Výtěžnost benzenu byla zjištěna u „spikovaného“ (fortifikace vzorku standardem) nápoje s obsahem benzenu 1 μg∙l⁻¹ a 10 μg∙l⁻¹ na 91 % a 98 %.

3.2 Výsledky studie

Poté, co se Americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv začal v roce 2005 zabývat opětovným výskytem benzenu v nealkoholických nápojích (Nyman et al., 2008), jsme se rozhodli prozkoumat situaci v České republice. V roce 2006 jsme analyzovali 23 vzorků z trhu (ochucené vody, ovocné a jiné nápoje), z toho 15 vzorků mělo deklarovaný obsah benzoátu a askorbové kyseliny na etiketě výrobku. Data pro výše zmíněné vzorky jsou shrnuta na obr. 1. Benzen byl identifikován v 17 vzorcích (74 %). Koncentrace benzenu u sedmi vzorků překročila přípustný limit pro vodu (1 μg∙l⁻¹); v těchto případech se koncentrace benzenu pohybovala v rozmezí od 1,1 až 3,2 μg∙l⁻¹; všechny tyto vzorky obsahovaly jak benzoát, tak askorbovou kyselinu. Korelace obsahu benzenu s obsahem benzoátu sodného a askorbové kyseliny ale nebyla statisticky signifikantní. Další faktory, které jsou uvedeny v literatuře jako promotory vzniku benzenu, např. přítomnost umělých sladidel, CO₂, vyšší obsah minerálních látek v důsledku použití minerální vody nebo ovocný obsah, také nebyly potvrzeny.

Obr. 1 Přehled výsledků, přítomnost benzoátu sodného, askorbové kyseliny (jak je uvedeno na etiketě) a benzenu v analyzovaných nealkoholických nápojích (2006)

Po skandálu v roce 2006 (ICBA, 2006; U.S. FDA, 2007) vyvstala otázka, zda výrobci reagovali úpravou svých receptur z pohledu eliminace přítomnosti benzenu. Což se do určité míry potvrdilo (U.S. FDA, 2007), avšak na trhu se objevili také výrobci noví a i jiní začali fortifikovat své produkty askorbovou kyselinou a ostatními nutrienty v reakci na poptávku konzumentů po zdravějších výrobcích. V roce 2011 jsme zopakovali průzkum trhu, stanovovali jsme obsah benzenu u 26 nealkoholických nápojů, z nichž 12 bylo buď nakoupených pod stejnými obchodními názvy jako v průzkumu v roce 2006, nebo byly zakoupeny výrobky s obdobným složením od stejného výrobce. Výsledky získané pro tyto vzorky jsou shrnuty na obr. 2 (označení prvních dvanácti vzorků odpovídá vzorkům na obr. 1). Devatenáct vzorků (73 %) obsahovalo detekovatelné koncentrace benzenu; jedenáct z nich bylo nad limit Evropské unie pro benzen v pitné vodě (1 μg∙l⁻¹) (ES, 1998), ale žádný z nich nebyl vyšší než limit Světové zdravotnické organice (10 μg∙l⁻¹) pro benzen v pitné vodě (WHO, 1996).

Obr. 2 Přehled výsledků, přítomnost benzoátu sodného, askorbové kyseliny (jak je uvedeno na etiketě) a benzenu v analyzovaných nealkoholických nápojích (2011)

Shrneme-li výsledky z let 2006 a 2011, měřitelné koncentrace benzenu byly stanoveny u 73 % vzorků (36 ze 49), část z těchto vzorků (13 výrobků) však neobsahovala současně benzoát a askorbovou kyselinu, což poukazuje na jiný zdroj kontaminace benzenem. Zároveň bylo zjištěno, že u 10 % vzorků (5 ze 49) s obsahem benzoátu, askorbové kyseliny i stopových množství přechodných kovů jako katalyzátorů reakce, nebyl identifikován žádný benzen, ačkoliv s ohledem na druh a složení nápoje by jeho vznik mohl být očekáván. Grafické vyjádření statistického zpracování výsledků (analýza hlavních komponent) je zobrazeno na obr. 3. Obrázek poukazuje na korelaci mezi jednotlivými složkami a benzenem. Jediná významná pozitivní korelace byla zjištěna mezi obsahem benzenu a obsahem benzoátu sodného. Zdá se, že více než složení způsobují pozitivní nálezy benzenu vnější kontaminace surovin a podmínky skladování (čas, teplota, UV záření), což koresponduje s literaturou (Nyman et al., 2010).

Obr. 3 Analýza hlavních komponent – korelace proměnných

Skutečnost, že všechny komerční vzorky zahrnuté do průzkumu byly analyzovány v první čtvrtině jejich garantované doby trvanlivosti, by mohla být důvodem ke vzniku relativně zanedbatelných koncentrací benzenu. Proto jsme se rozhodli otestovat vliv podmínek skladování na obsah benzenu a ve spolupráci s jedním z největších tuzemských výrobců byly provedeny neurychlené skladovací experimenty zaměřené na tvorbu benzenu. Kinetika tvorby benzenu během 6 měsíců v nápojích obsahujících oba prekurzory a mineralizovanou vodu je znázorněna na obr. 4. Za optimálních podmínek (Cu a Fe ionty z minerální vody, UV záření, pokojová teplota) byl pozorován nárůst koncentrace benzenu z nuly na téměř 4 μg∙l⁻¹.

Obr. 4 Skladovací experiment nealkoholických nápojů (průměrné hodnoty ze tří nezávislých měření)

4 Závěr

Koncentrace benzenu ve všech 49 reálných vzorcích byla nižší než 10 μ g∙l⁻¹, výsledky průzkumu odpovídají celosvětové situaci. Přestože od roku 2006 někteří výrobci zodpovědně minimalizovali přítomnost benzenu ve svých nápojích díky přeformulování receptur výrobků, průměrný obsah benzenu zůstává stejný okolo 1 μg∙l⁻¹. Studie ukázala, že obsah benzenu není snadné předvídat, ale pokud jsou prekurzory přítomny ve výrobku, existuje vždy vysoká pravděpodobnost vzniku benzenu. Ačkoliv ve srovnání s jinými zdroji expozice je příjem benzenu z nealkoholických nápojů zanedbatelný, lze výrobcům doporučit provádět specifické testy skladovatelnosti pro každý produkt s obsahem jak přírodní kyseliny benzoové a askorbové, tak v případě jejich použití jako aditiva.