Porovnanie obsahu prchavých sírnych zlúčenín v slovenských pivách metódou SPME

Práca porovnáva obsah prchavých sírnych zlúčenín v slovenských pivách. Sú to látky s výraznou senzorickou charakteristikou a nízkym prahom detekcie, preto môžu arómu piva ovplyvniť negatívne už v stopových množstvách. V pive bolo identifikované veľké množstvo týchto látok, medzi najvýznamnejšie patria dimetylsulfid, dimetyldisulfid, dimetyltrisulfid, etántiol, etyltioacetát, metántiol, metionol, metyltioacetát, 3-metyltiopropylacetát a sírouhlík.

V prvom kroku sa optimalizovali podmienky adsorpcie na SPME vlákno - teplota adsorpcie, čas adsorpcie, objem vzorky a prídavok solí, následne sa meral obsah prchavých sírnych zlúčenín v pive plynovou chromatografiou s plameňovým fotometrickým detektorom (GC-FPD) po mikroextrakcii na tuhú fázu (SPME). Boli použité dva vnútorné štandardy - etylmetylsulfid a 1-propyltioacetát. Zistili sa rozdiely v zastúpení jednotlivých zlúčenín v pivách rôznych značiek aj rozdiely medzi pivami s rôznou stupňovitosťou.

1 ÚVOD

Pivo je komplexná zmes, v ktorej bolo doposiaľ identifikovaných viac ako 620 prchavých látok. Spomedzi nich sa na tvorbe arómy významne podieľajú aj zlúčeniny s obsahom síry. Ich výrazné senzorické charakteristiky a nízky prah detekcie však môžu na konzumentov vplývať aj značne negatívne už v stopových množstvách (1) . Vzhľadom na princíp funkcie čuchového ústrojenstva je vnímanie vôní značne individuálne a čuchový vnem pre konkrétnu látku sa môže meniť aj v závislosti od jej koncentrácie. Kým v stopových koncentráciách sú niektoré z týchto látok žiaduce pre typickú arómu, zvýšením ich koncentrácie môže dôjsť až k výrazne negatívnemu ovplyvneniu celkovej arómy (2).

Hoci v pive bolo identifikovaných veľa prchavých zlúčenín s obsahom síry, väčšina z nich sa vyskytuje len v stopových množstvách. Medzi hlavné sírne komponenty piva patrí dimetylsulfid (DMS) a 3-metyltiopropanol (metionol) [1, 3]. Zdroje sírnych látok pre tvorbu prchavých sírnych zlúčenín pochádzajú zo sladu a chmeľu. Väčšina senzoricky aktívnych sírnych zlúčenín neprechádza do piva priamo zo surovín, ale vzniká v priebehu fermentačného procesu, kedy bunky kvasiniek metabolickými premenami tvoria z neprchavých sírnych látok prchavé (1). Niektoré však prechádzajú do piva priamo z chmeľu, iné vznikajú aj chemickými premenami v procese starnutia piva (3, 4). Ešte stále nie sú celkom známe mechanizmy syntézy všetkých týchto látok, no je známe, že ich tvorba je v priebehu fermentácie ovplyvnená množstvom faktorov, ako sú vlastnosti kvasničného kmeňa, nedostatok živín, katióny kovov, redoxný potenciál a teplota fermentácie (4).

Vzhľadom na nízky obsah prchavých sírnych zlúčenín v pive je potrebné pred vlastnou chromatografickou analýzou tieto látky vo vzorke zakoncentrovať. Klasickou metódou je extrakcia do nepolárneho rozpúšťadla alebo statická headspace extrakcia, no tieto metódy majú viaceré negatíva a obmedzenia, ako je časová náročnosť, škodlivý vplyv rozpúšťadiel a nedostatočná citlivosť. Na niektoré extrémne prchavé zlúčeniny sú tieto metódy dokonca nepoužiteľné. Alternatívnou, relatívne novou prekoncentračnou metódou je mikroextrakcia na tuhú fázu (SPME – Solid-Phase Micro-Extraction). Pri použití tejto techniky sa prchavé zlúčeniny adsorbujú na povrch tenkého vlákna s nanesenou vrstvou aktívnej adsorpčnej látky. Následne sa vlákno desorbuje v injektore plynového chromatografu a vzorka sa štandardne analyzuje. Aj po zakoncentrovaní je však obsah sírnych zlúčenín vo vzorke veľmi nízky, preto sa na detekciu týchto látok po separácii používajú selektívne detektory, ako je plameňovo-fotometrický detektor (FPD – Flame Photometric Detector), chemiluminiscenčný detektor (SCD – Sulphur Chemiluminescent Detector), resp. inovovaná verzia FPD, pulzný plameňovo-fotometrický detektor (PFPD – Pulsed Flame Photometric Detector), ktorý vykazuje veľmi vysokú citlivosť na sírne zlúčeniny (4).

Cieľom práce bolo optimalizovať metódu pre meranie profilu sírnych látok v pive a porovnať obsah prchavých sírnych látok v pivách slovenskej proveniencie. Sledovala sa závislosť odozvy detektora od použitého objemu vzorky, teploty a času extrakcie, procesu úpravy vzorky pred analýzou a prídavku anorganických solí do vzorky.

2 MATERIÁL A METÓDY

2.1 Vzorky

Na analýzu bolo použitých 12 vzoriek výčapných pív a 11 ležiakov pochádzajúcich z ôsmich slovenských pivovarov. Vzorky boli zakúpené v obchodnej sieti.

2.2 SPME

Na extrakciu sírnych zlúčenín z headspace priestoru sa použilo SPME vlákno 50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS Stableflex (57348-4) od firmy Supelco (Bellefonte, PA, USA), GC bol vybavený modifikovaným autosamplerom Combi PAL (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland) umožňujúcom prácu v móde SPME.

2.3 Chromatografia

Analýzy prebiehali na prístroji Agilent 6890A vybavenom plameňovým fotometrickým detektorom v móde pre selektívnu detekciu sírnych látok (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) s nasledovným prietokom plynov do detektora: vodík 50 ml/min, vzduch 60 ml/min, dusík 60 ml/min. Kapilárna chromatografická kolóna Varian (CP 8946) FactorFour VF-5MS 30 m X 0,25 mm ID DF=1,0 (Varian, Darmstadt, Germany).

2.4 Príprava vzorky

Vzorky piva boli pred analýzou vychladené v chladničke na teplotu 4 °C, aby sa zamedzilo úniku prchavých frakcií (5). Po otvorení bolo pipetovaných 6 ml vzorky do sklenej vzorkovnice na lisovateľný uzáver s objemom 20 ml obsahujúcej 0,6 g NaCl a sklené magnetické miešadlo. Pred uzatvorením vzorkovnice uzáverom s PTFE septom sa ku každej vzorke pridalo 10 l roztoku vnútorného štandardu s obsahom etylmetylsulfidu (EMS) a 1-propyl-tioacetátu (PrSAc) v etanole (50 % v/v) s takou koncentráciou, aby bol výsledný obsah EMS vo vzorke 20 μg/l a PrSAc 5 μg/l (1).

2.5 Extrakcia a separácia

Pred vlastnou extrakciou boli vzorky počas miešania 5 minút temperované na teplotu extrakcie. Extrahovalo sa z priestoru nad miešanou vzorkou a následne desorbovalo 10 minút v injektore plynového chromatografu v splitless móde pri 270 °C. Ako nosný plyn bolo použité hélium s prietokom 1,8 ml/min. Pre začiatok teplotného programu separácie bola zvolená teplota 35 °C, pri ktorej sa zotrvalo 2 min, nasledoval prechod na 90 °C rýchlosťou 5 °C/min, 2 min pri 90 °C, ďalej prechod na 110 °C rýchlosťou 5 °C/min, 2 min pri 110 °C a napokon prechod rýchlosťou 25 °C/min na teplotu 280 °C a 3 min pri 280 °C.

3 VÝSLEDKY A DISKUSIA

Meraním vzoriek piva pri rôznych podmienkach a analýzou získaných údajov sa zvolila optimálna teplota, objem vzorky a prídavok NaCl pre stanovenie prchavých sírnych zlúčenín v pive. Ako vyplýva z obr. 1, optimálny objem vzorky pri použití 20 ml vzorkovnice je 5–6 ml. Preto sa v ďalšej sérii experimentov pracovalo s objemom vzorky 6 ml.

Zo série grafov na obr. 2a–2d je zrejmé, že so zvyšujúcou sa teplotou a časom extrakcie sa zvyšuje efektivita extrakcie látok s vyšším bodom varu, ako sú 3-metyltiopropanol a 3-metyltiopropylacetát, na úkor prchavejších látok – metántiol, dimetylsulfid.

Obr. 1 Závislosť plochy píkov od objemu vzorky pre látky s rôznym retenčným časom. Podmienky extrakcie: 40 min pri 40 °C. Hodnoty pre 6 ml zodpovedajú 100 %.

Obr. 2a Závislosť plochy píkov od času extrakcie pri 35 °C pre objem vzorky 6 ml. 100 % predstavujú hodnoty namerané po extrakcii 45 minút pri 40 °C.

Obr. 2b Závislosť plochy píkov od času extrakcie pri 40 °C pre objem vzorky 6 ml. 100 % predstavujú hodnoty namerané po extrakcii 45 minút pri 40 °C.

Obr. 2c Závislosť plochy píkov od času extrakcie pri 45 °C pre objem vzorky 6 ml. 100 % predstavujú hodnoty namerané po extrakcii 45 minút pri 40 °C.

Obr. 2d Závislosť plochy píkov od času extrakcie pri 50 °C pre objem vzorky 6 ml. 100 % predstavujú hodnoty namerané po extrakcii 45 minút pri 40 °C.

Ďalej sa sledoval vplyv úpravy vzorky na stanovenie. Vzorky piva, v ktorých bol oxid uhličitý odstránený účinkom ultrazvuku, poskytovali porovnateľné výsledky ako vzorky neupravené, avšak reprodukovateľnosť sa ukázala byť vyššia pri vzorkách bez úpravy.

Prídavok anorganických solí znižuje bod varu látok vo vzorke, čo v niektorých prípadoch zvyšuje efektivitu extrakcie. Z tohto dôvodu bol testovaný prídavok 10 % NaCl alebo Na₂SO₄ k vzorke. Prídavok solí významne zvyšuje množstvo látok s vyšším bodom varu, ktoré sa adsorbujú na SMPE vlákno pri rovnakých podmienkach extrakcie ako bez prídavku soli. NaCl sa v tomto smere ukázal byť efektívnejší ako Na₂SO₄.

Na základe výsledkov meraní sa zistilo, že optimálne podmienky času a teploty extrakcie sú 40 minút pri 40 °C, resp. 30 minút pri 45 °C, avšak s prídavkom NaCl, ktorý výrazne zvyšuje množstvo extrahovaných látok na SPME vlákno. Z hľadiska efektívneho využitia prístroja je vhodnejšie použiť časovo menej náročný variant, pretože čas analýzy je takisto 30 minút. Preto boli pre SPME extrakciu pri použití vzorkovníc s objemom 20 ml zvolené nasledovné podmienky: objem vzorky: 6 ml, teplota extrakcie: 45 °C, čas extrakcie: 30 minút, prídavok NaCl: 0,6 g.

Obr. 3 znázorňuje typický FPD chromatogram SPME vzorky piva. Vyskytujú sa tam píky všetkých bežných sírnych zlúčenín obsiahnutých v pive a píky vnútorných štandardov etylmetylsulfidu a propyltioacetátu.

Obr. 3 Typický FPD chromatogram SPME vzorky piva

Identifikované píky

1. Metántiol (MeSH)
2. Dimetylsulfid (DMS)
3. Sulfid uhličitý (CS₂)
4. Etylmetylsulfid (EMS) / vnútorný štandard
5. Metyltioacetát (MeSAc)
6. Dimetyldisulfid (DMDS)
7. Etyltioacetát (EtSAc)
8. Propyltioacetát (PrSAc) / vnútorný štandard
9. 3-metyltiopropanol (metionol)
10. 3-metyltiopropylacetát (3-MeSPrAc)

Pri meraní vzoriek piva je nevyhnutné zabezpečiť, aby bola meraná vždy čerstvo pripravená vzorka, z dôvodu výrazných zmien v pive počas státia pri izbovej teplote. Metántiol podlieha dimerizácii na dimetyldisulfid, časom dochádza aj k tvorbe sulfidu uhličitého. Tento fakt vedie aj k problémom pri kvantifikácii, napr. pri metántiole dochádza k okamžitej dimerizácii väčšiny štandardu. Namerané hodnoty niektorých prchavých sírnych zlúčenín výrazne závisia od koncentrácie etanolu vo vzorke. Etanol viaže tieto látky v roztoku, čo vedie k ovplyvneniu extrakcie, a preto je ich nameraná koncentrácia nižšia ako skutočná. Tento problém sa rieši použitím vnútorných štandardov. Každá vzorka bola meraná minimálne trikrát.

Ako vidno z tab. 1, nie je možné na prvý pohľad určiť jednoznačný trend obsahu prchavých sírnych zlúčenín v pive v závislosti od pivovaru, ani od stupňovitosti piva. Aj rozdiely medzi jednotlivými značkami v produkcii jedného pivovaru sú značné.

Tab. 1 Priemerné plochy píkov sírnych zlúčenín vo vzorkách slovenských pív (N – nemerateľné hodnoty)

Senzorickou analýzou sa zistilo, že sírne zlúčeniny ani v jednom prípade negatívne neovplyvňovali arómu piva.