Stanovení některých vedlejších produktů dezinfekce ve varní vodě a v pivu

Při výrobě piva je nutné věnovat náležitou pozornost dezinfekci technologického zařízení. Nejčastěji se vyskytujícími vedlejšími produkty dezinfekce jsou trihalogenmethany a halogenoctové kyseliny. Tato práce popisuje vývoj účinné metody pro stanovení kyseliny chloroctové, bromoctové a jodoctové ve varní vodě a v pivu. K přečištění byla použita metoda extrakce na pevné fázi. Za tímto účelem bylo zkoušeno několik různých typů SPE kolonek. Látky byly stanoveny po methylaci na plynovém kapilárním chromatografu vybaveném detektorem elektronového záchytu. Ke kvantitativnímu stanovení byla použita metoda vnitřního standardu. Postup je vhodný pro rutinní stanovení halogenoctových kyselin v pivu. Obsah halogenoctových kyselin ve zkoumaných českých pivech byl vždy pod mezí detekce.

1 ÚVOD

Mezi vedlejší produkty vznikající při úpravě pitné vody patří toxické trihalogenmethany (1,2) a halogenoctové kyseliny. Při nedostatečném proplachu technologického zařízení po provedené sanitaci se mohou halogenoctové kyseliny také objevit až ve finálním produktu, v pivu (3–5). Přítomnost těchto látek v nápojích je již řadu let zakázána (6).

Většina publikovaných metod je založena na různých způsobech extrakce a derivatizace halogenoctových kyselin a jejich následném stanovení pomocí plynové chromatografie (7–10). K detekci se nejčastěji používají detektor elektronového záchytu nebo hmotnostní detektor (7–12). Většinou se k extrakci používala extrakce v systému kapalina-kapalina (7–10). Jinou možností izolace těchto látek je metoda extrakce na pevné fázi (SPE) (13–15).

Halogenoctové kyseliny se stanovují po jejich derivatizaci, obvykle methylací BF₃/MeOH (13), ethylací s EtOH/H₂SO₄ (9, 16), butylací pomocí BF₃/n-BuOH (10) nebo pentafluorbenzylací s pentanfluorbenzylbromidem (PFBBr) (10, 16).

Cílem této práce bylo optimalizovat metodu pro stanovení halogenoctových kyselin v pivu. V rámci přečištění bylo odzkoušeno několik SPE kolonek naplněných čtyřmi různými typy sorbentů. K derivatizaci byla použita methylace činidlem BF₃/methanol.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Chemikálie a činidla

Methanol p. a., ethanol p. a., síran sodný bezvodý p. a., kyselina chlorovodíková p. a. byly nakoupeny od firmy Lachema (ČR), ethylacetát p. a., 20% roztok BF₃/MeOH, hexan, kyseliny chloroctová, dichloroctová, bromoctová a jodoctová byly získány od fy Merck (Německo). Ultračistá voda byla získána z přístroje Milli-Q grade Millipore (USA).

Přehled testovaných SPE kolonek a jejich parametrů je uveden v tab. 1.

Tab. 1 SPE kolonky použité pro stanovení halogenoctových kyselin

2.2 Přístroje

Vlastní stanovení bylo provedeno na plynovém chromatografu Carlo Erba HRGC 5300 Mega Series s detektorem elektronového záchytu. Byly vyzkoušeny tři různé křemenné kapilární kolony: SPB-5 o délce 30 m a vnitřním průměru 0,32 mm s tloušťkou filmu 0,25 μm; DB-1301 o délce 30 m a vnitřním průměru 0,32 mm s tloušťkou filmu 0,25 μm; DB-5 o délce 60 m a vnitřním průměru 0,32 mm s tloušťkou filmu 1,0 μm.

2.3 Příprava vzorku

Před použitím byly SPE kolonky kondiciovány 3 ml methanolu a poté 3 ml ultračisté vody. V dalším kroku bylo skrz kolonku prosáto za pomoci vakua 20 ml vzorku. Sorbent kolonky byl následně promyt 1 ml ultračisté vody. K eluátu byly přidány 2 g NaCl a 10 μl vnitřního standardu dichloroctové kyseliny. Hodnota pH vzorku byla upravena přídavkem koncentrované kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 0,5 za použití pH metru a vzorek byl vložen na dobu 1 min do ultrazvukové lázně. Poté byly halogenoctové kyseliny intenzivním třepáním vyextrahovány 4 x 2,5 ml ethylacetátu. Po následné centrifugaci při 3900 ot/min po dobu 4 min byla odebrána ethylacetátová vrstva. Roztok ethylacetátu byl vysušen 2 g bezvodého síranu sodného a ethylacetát byl odpařen do sucha na vakuové rotační odparce při 35 °C.

Odparek byl rozpuštěn ve 2 ml methanolu a pak byl přidán 1 ml BF₃/MeOH. Roztok byl převeden do šroubovací skleněné vialky a po uzavření byla vialka umístěna na dobu 60 min do vodní lázně o teplotě 85 °C.

Po methylaci byl roztok zchlazen na laboratorní teplotu a extrahován 1,5 ml hexanu protřepáním v ruce po dobu 1 min. Hexanová vrstva byla oddělena a buď ihned nastříknuta do injektoru plynového chromatografu nebo v uzavřené vialce skladována při teplotě –18 °C po dobu několika dnů.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Nejprve byly optimalizovány podmínky plynové chromatografie. Nejlepších výsledků bylo dosaženo na koloně DB-5 o délce 60 m a vnitřním průměru 0,32 mm a tloušťce filmu 1,0 μm. Chromatografické píky všech stanovovaných látek byly dobře separovány bez ovlivnění interferencemi. Ostatní kolony poskytly horší separaci.

Optimalizované podmínky pro plynově chromatografickou separaci byly následující: kolona byla vyhřívána na 60 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 3 °C/min do 80 °C a následně teplotní růst rychlostí 40 °C/min do 285 °C. Injektor byl použit v režimu splitsplitless a split ventil byl otevřen po 0,5 min. Teplota injektoru byla 250 °C a detektoru elektronového záchytu 320 °C. Jako nosný plyn bylo použito helium v kvalitě 5.0, a to při tlaku 55 kPa při 60 °C. Dusík v kvalitě ECD o tlaku 150 kPa byl použit jako přídavný plyn pro detektor.

Dále byla pozornost věnována nalezení nejlepších podmínek pro extrakci. Výsledky získané se sorbentem Extrelut byly neuspokojivé (výtěžnost < 5 % při obohacení 100 μg/l každou látkou). Nízká výtěžnost může být způsobena degradací sorbentu při nízké hodnotě pH 0,5.

SPE kolonky Separon SGX CN poskytly podobně špatné výsledky. O něco lepších výsledků bylo dosaženo na kolonkách naplněných sorbentem Bond Elut SAX, kde se výtěžnost chloroctové kyseliny pohybovala okolo 25 %, ale pro další kyseliny dosahovala hodnoty jen asi 10 %. Nejlepší výtěžnost poskytly kolonky Separcol Si C18 (Anapron, Slovensko). Z tohoto důvodu byly všechny experimenty za účelem zjištění validačních parametrů metody dělány na tomto sorbentu.

Validační charakteristiky jsou shrnuty v tab. 2. Správnost metody byla zjištěna pomocí výtěžnosti jednotlivých halogenoctových kyselin. Detekční limit byl stanoven jako 3 × S/N (S = signál, N = šum). Opakovatelnost postupu byla určena opakovaným měřením (pětkrát během jednoho dne) jednoho a téhož vzorku piva s přídavkem halogenoctových kyselin na koncentrační hladině 100 μg/l každé látky.

Tab. 2 Validační parametry: výtěžnost, mez detekce a RSD pro stanovení halogenoctových kyselin v pivu

Na základě takto optimalizovaného postupu bylo na obsah halogenoctových kyselin zanalyzováno osm českých piv. Všechny výsledky byly negativní (tab. 3).

Tab. 3 Obsah halogenoctových kyselin v osmi vzorcích českých piv. *) N – pod mezí detekce

4 ZÁVĚR

Byla vyvinuta metoda, která umožňuje stanovení halogenoctových kyselin, jakožto možných vedlejších produktů po sanitaci, po přečištění pomocí metody SPE, jejich extrakci ethylacetátem a derivatizaci pomocí BF₃/MetOH v desetinách respektive setinách mg/l piva, a to pomocí plynové chromatografie s detektorem elektronového záchytu. Tento postup je vhodný pro rutinní kontrolu obsahu halogenoctových kyselin v pivu.