Optimalizace stanovení obsahu dimethylsulfidu v mladině a pivu

Sirné sloučeny přítomné v ječmeni, sladu a pivu jsou většinou netěkavé látky (aminokyseliny, bílkoviny, anorganické sírany), ze kterých mohou za určitých podmínek vznikat těkavé senzoricky aktivní látky. Přítomnost těchto látek v pivu může negativně ovlivnit jeho organoleptické vlastnosti. Jednou z nejsledovanějších těkavých sirných sloučenin v pivu je dimethylsulfid (DMS), proto je nutné mít vhodnou analytickou metodu ke sledování jeho obsahu. Ke stanovení obsahu DMS v mladině a pivu byla optimalizována a validována metoda statické headspace ve spojení s plynovou chromatografií s plamenovým fotometrickým detektorem (HS-GC-FPD). Optimální výtěžnost HS extrakce byla dosažena po 30 minutách při teplotě 50 °C. Obsahy DMS v analyzovaných mladinách se pohybovaly od 9,6 do 59,6 μg.l⁻¹, v pivech od 6,1 do 34,9 μg.l⁻¹.

1 ÚVOD

V poslední době je celosvětově a rovněž v České republice věnována zvýšená pozornost senzoricky aktivním látkám ovlivňujícím kvalitu piva. Na senzorickém charakteru i analytickém složení piva se spolupodílí kvalita pivovarských surovin, technologie výroby sladiny a mladiny i technologie kvašení a zrání piva (Landaud et al., 2008; Basařová et al., 2010). Mezi senzoricky aktivními látkami ovlivňujícími kvalitu piva hrají významnou úlohu heterocyklické a sirné sloučeniny, z nichž některé se vyznačují vysokou senzorickou aktivitou i v extrémně nízkých koncentracích (Miracle et al., 2005; Basařová et al., 2015).

Dimethylsufid (DMS) je v současné době nejsledovanější sirnou sloučeninou, která výrazně ovlivňuje senzorické vlastnosti piva. Jeho obsah se pohybuje v rozmezí jednotek až stovek μg.l⁻¹ v závislosti na typu piva, použité technologii a surovinách, především sladu. Názory na prahovou koncentraci dimethylsulfi du se liší, ale většinou se považuje za hranici hodnota okolo 50 μg.l⁻¹ (Basařová et al., 2010). Protože v nižších koncentracích je považován za aromatickou složku ležáckých piv, je jeho určitá koncentrace nezbytná, ba dokonce žádoucí. Charakteristická vůně dimethylsulfidu je udávána po vařené zelenině (kapustě či zelí).

Přímá analýza sirných senzoricky aktivních látek je možná jen zřídka, protože se nacházejí v analyzovaných matricích (slad, pivo) ve velmi nízkých koncentracích (μg.l⁻¹ – ng.l⁻¹). Před vlastní analýzou je třeba analyty extrahovat z matrice a zakoncentrovat (Scarlata a Ebeler, 1999). Výběr vhodné metody přípravy vzorku pak výrazně ovlivňuje rychlost, spolehlivost a přesnost analýzy.

Těkavé látky lze z kapalných vzorků izolovat šetrnou extrakcí plynem, tedy s využitím tzv. headspace techniky (HS). Podstatou těchto metod je analýza plynné fáze, která byla v kontaktu s extrahovaným materiálem, v ideálním případě až do ustavení rovnovážné distribuce těkavých látek mezi plynnou a kondenzovanou (kapalnou) fází, která je popsána distribuční konstantou jednotlivých složek v dané soustavě (Kolb, 1999).

Rozlišují se dva způsoby uspořádání headspace analýzy:

a) Statická headspace

V tomto uspořádání se analyzuje vzorek plynu odebraný z prostoru nad kondenzovanou fází ve statickém uzavřeném systému.

b) Dynamická headspace

Kondenzovaná fáze se kontinuálně extrahuje proudem inertního plynu (tzv. stripování), z něhož jsou vynášené páry těkavých látek vhodným způsobem zachycovány.

K separaci sirných těkavých látek bývá nejčastěji využívána plynová chromatografie ve spojení se selektivními detektory (Xiao et al., 2005; Hill a Smith, 2000). Selektivní detektory jsou obzvláště výhodné při analýzách rozmanitých sirných látek ve složitých matricích. Tyto detektory mohou redukovat časově náročné čištění vzorků, které může být příčinou znečištění vzorků dalšími kontaminanty, nebo dokonce ztráty stanovovaných analytů.

Stále nejvíce používaným detektorem pro analýzu sirných látek je plamenový fotometrický detektor (FPD). Tento detektor sice vykazuje nelineární (exponenciální) odezvu na sirné látky v závislosti na jejich koncentraci, ale je poměrně levný, robustní a postačující pro mnoho aplikací (Wardencki, 1998; Mestres et al., 1997).

Alternativou k plamenově fotometrickému detektoru je pulzní plamenově fotometrický detektor (PFPD). Detektor využívá zdroje plynu plamene v dávkování tak, aby plamen nebyl trvalý. Pulzní zapalování je viditelné a plamen sám zhasíná. Tento cyklus se opakuje 2–4 krát za sekundu. Selektivita je zabezpečena vhodným filtrem a časovou dimenzí (Hill a Smith, 2000).

Další možností je sirný chemiluminiscenční detektor (SCD). Nejnovější aplikace metod založených na detekci tímto detektorem dokazují, že jeho nízký detekční limit, stabilita a lineární odezva pro sirné látky jsou důvodem, proč je tento detektor doporučován pro analýzu extrémně složitých matric (Wardencki, 1998; Miracle et al., 2005).

V posledních letech se začal pro stanovení sirných látek využívat atomový emisní detektor (AED). V AED vstupuje plyn z chromatografické kolony do plazmové hlavice, atomizuje se a emituje záření. To se po rozkladu mřížkou analyzuje diodovým polem a určí se obsahy prvků. Tento detektor se používá k posouzení elementárního složení látek (Wardencki, 1998).

Kombinace plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií je vhodné při identifikaci těkavých sirných látek v různých matricích (Wardencki, 1998). K separaci těkavých sirných látek metodou plynové chromatografie se používají kolony s polární stacionární fází polyethylenglykolu nebo s mírně polární fází 5 % – fenyl-95 % – dimethylpolysiloxanu.

2 MATERIÁL A METODY

Ke stanovení obsahu volného DMS ve vzorcích mladiny a piva byla použita optimalizovaná metoda headspace (HS) v kombinaci s plynovou chromatografií s plamenově fotometrickým detektorem. Pro HS extrakci byla optimalizována teplota a doba extrakce.

2.1 Použité chemikálie a přístroje

Standardy: (dimethylsulfid, ethylmethylsulfid), ethanol.

Pro stanovení obsahu DMS ve vzorcích mladiny a piva byl použit plynový chromatograf Trace GC Ultra s FPD detektorem. Separace byla provedena na kapilární koloně GS-Gaspro (60 m x 0,32 mm), nosným plynem bylo helium.

2.2 Optimalizace doby headspace extrakce

Při optimalizaci doby HS extrakce DMS z analyzovaného vzorku byly výtěžnosti extrakce testovány v čase 10 až 50 minut v desetiminutových intervalech při teplotě 40 °C. Jako optimální čas byla vybrána doba extrakce 30 minut.

2.3 Optimalizace teploty headspace extrakce

Při optimalizaci teploty HS extrakce DMS z analyzovaného vzorku byly výtěžnosti extrakce testovány při teplotách 30 až 70 °C v desetistupňových intervalech při optimalizované době extrakce (30 min). Jako optimální teplota HS extrakce DMS ze vzorku byla vybrána teplota 50 °C.

2.4 Příprava vzorku pro headspace analýzu

Do 10 ml vialky bylo odměřeno 0,5 ml ethanolu, zazátkovaná vialka byla 15 min vychlazena na teplotu 5 °C. Do připravené vychlazené vialky bylo napipetováno 5 ± 0,1 ml vychlazeného vzorku mladiny (piva), přidáno 2 ml roztoku vnitřního standardu EMS a vialka byla uzavřena víčkem se septem. Takto připravený vzorek byl použit pro headspace extrakci za optimálních podmínek (50 °C, 30 min).

2.5 Instrumentace a chromatografické stanovení

Vlastní stanovení DMS bylo prováděno na plynovém chromatografu Trace Ultra s FPD detektorem, identifikace byla provedena na plynovém chromatografu Trace Ultra s MSD detektorem. K separaci byla použita kapilární kolona GS-Gaspro (60 m x 0,32 mm) s následujícím teplotním programem: počáteční teplota 40 °C po dobu 1 min, nárůst teploty 4 °C.min⁻¹ do 240 °C, doba setrvání 15 min. Konstantní průtok nosného plynu He 1,5 ml.min⁻¹. Teplota FPD detektoru 180 °C, průtok vzduchu 105 ml.min⁻¹, průtok vodíku 90 ml. min⁻¹, průtok dusíku (make-up) 20 ml.min⁻¹.

Identifikace analyzovaného DMS byla provedena na základě porovnání retenčních časů se standardem (obr. 1), kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky (obr. 2).

Obr. 1 Chromatogram analyzovaného vzorku mladiny (koncentrace DMS 59,6 μg.l⁻¹) – DMS (RT 15.75 min), EMS (RT 18.23 min)

Obr. 2 Kalibrační křivka DMS

2.6 Validace metody

Byly stanoveny následující validační parametry: kalibrační závislost, kombinovaná standardní nejistota mez stanovení.

Kalibrační závislost koncentrace DMS na odezvě FPD detektoru byla exponenciální. Po analýze kalibračních roztoků standardu DMS v koncentračním rozmezí od 6,7 do 118,5 μg.l⁻¹ byla sestrojena kalibrační křivka. Na obr. 2 je znázorněna kalibrační křivka s regresní rovnicí a hodnotou spolehlivosti.

Kombinovaná standardní nejistota metody byla vypočítána z opakovatelnosti měření obsahu DMS v analyzovaných vzorcích. Počet opakování pro výpočet nejistoty bylo 10 pro mladinu i pivo. Kombinovaná standardní nejistota metody byla 5,9 %.

Mez stanovení je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze s definovanou přesností kvantitativně stanovit. Je to mez, kdy analyt vyvolá odezvu měřicího přístroje (S) větší než je desetinásobek úrovně šumu pozadí (N), tedy S/N = 10. Mez stanovení obsahu DMS v analyzovaných vzorcích mladiny a piva byla stanovena výpočtem z chromatogramu a její hodnota byla 3,5 μg.l⁻¹.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Optimalizovaná metoda HS extrakce ve spojení s plynovou chromatografií s FPD detektorem byla validována. Mez stanovení volného DMS ve vzorcích mladiny a piva byla 3,5 μg.l⁻¹, kombinovaná standardní nejistota 5,9 %, R2=0,9998.

Výtěžnost HS extrakce v závislosti na době extrakce byla testována v 10minutových intervalech od 10 do 50 min. Testovací teplota byla zvolena 40 °C, což je teplota bodu varu DMS. Z grafické závislosti je patrné, že do 20 min dochází k prudkému nárůstu výtěžnosti, v době od 20 do 30 min je nárůst extrakce pozvolnější. Od 30 min dochází k ustálení extrakce. Z těchto závislostí vyplývá, že nejoptimálnější doba extrakce je 30 min. Na obr. 3 je znázorněna závislost ploch píků DMS / EMS na době HS extrakce.

Obr. 3 Optimalizace času HS – extrakce

Výtěžnost HS extrakce v závislosti na teplotě extrakce byla testována po 10 °C od 30 do 70 °C. Grafická závislost ukazuje strmý nárůst výtěžnosti od 30 do 50 °C, při teplotách nad 50 °C dochází k mírnému poklesu. Nejvyšší výtěžnost HS extrakce byla při 50 °C a tato teplota byla zvolena jako optimální. Na obr. 4 je znázorněna závislost ploch píků DMS / EMS na teplotě HS extrakce.

Obr. 4 Optimalizace teploty HS – extrakce

Optimalizovanou extrakční metodou HS ve spojení s plynovou chromatografií s FPD detektorem bylo analyzováno 80 vzorků mladin a 25 vzorků piv. Obsahy DMS v analyzovaných mladinách se pohybovaly od 9,6 do 59,6 μg.l⁻¹, v pivech od 6,1 do 34,9 μg.l⁻¹.

4 ZÁVĚR

Z výsledků optimalizace a validace metody vyplývá, že metoda HS v kombinaci s plynovou chromatografi í s plamenově fotometrickým detektorem je vhodná pro stanovení obsahu volného DMS v mladině a pivu.